Channelrhodopsin2 تحفيز ساطة من الإمكانيات في متشابك ذبابة الفاكهة العضلية المفارق

تبدأ هذه العملية بتربية ذباب الفاكهة (drosophila). تُستخدم يرقات في طورها الثالث ذات النمط الجيني المناسب، والتي نُميت على غذاء يحتوي على all trans retinol. يتم بعد ذلك تثبيت كل يرقة بدبابيس من جهتي الرأس والذيل.

ثم يتم جعل الـ FLA مسطحة. بعد ذلك، يتم قطع الدماغ والأعصاب الخلفية لإيقاف النشاط الحركي الإيقاعي. تالياً، يتم ضبط مصدر ضوء LED الأزرق مع صندوق التحكم وتركيزه على العينة.

أخيراً، استخدم قطباً كهربائياً حاداً لثقب العضلة السادسة. ثم وجه نبضات ضوئية باستخدام مصدر جهد كهربائي. مرحباً، أنا نيكولاس مارستين من مختبر الدكتورة ليزلي غريفيث، قسم الأحياء في جامعة برانديس.

مرحباً، أنا ستيفان بولفر من مختبر غريفيث أيضاً. سنعرض لكم اليوم إجراء استثارة الجهود المشبكية في غياب القناة root absent two عند الوصلة العصبية العضلية في يرقة drosophila. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الفسيولوجيا المشبكية في drosophila.

كما نستخدمه أيضاً لتدريس الطلاب فسيولوجيا المشابك العصبية والمختبرات التعليمية. لذا، دعونا نبدأ. للبدء في هذا البروتوكول، حافظ على سلالات ذباب UAS channel redsin two و 3 7, 1 gal four في زجاجات منفصلة تحتوي على أوساط تربية الذباب القياسية.

اجمع الذباب العذارى من خطوط الذباب الأربعة 3 7 و1 gal، والذكور من خطوط UAS channel redsin. بعد ذلك، قم بتحضير وسط غذائي للذباب ممزوج بـ 1 millimolar من الـ all trans retinol أو TR. وللقيام بذلك، قم بإذابة الوسط الغذائي العادي للذباب في الميكروويف لمدة دقيقة واحدة تقريبًا.

بمجرد الذوبان، اترك الوسط ليبرد لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 ثانية، ثم أضف 100 µL من a TR بتركيز 100 mM في 100% ethanol لكل 10 mL من وسط تربية الذباب. وعندما تصبح القوارير التي تحتوي على وسط a TR جاهزة، ضع الذكور والإناث التي تم جمعها في كل قارورة. ضع القوارير في منطقة مظلمة عند درجة حرارة من 22 إلى 25 °C للسماح للذباب بالتزاوج ووضع البيض، ثم انتظر لمدة أربعة إلى خمسة أيام حتى تظهر يرقات instar الثالثة.

في هذه المرحلة، يمكنك التخلص من الذباب البالغ. نحن الآن مستعدون للمضي قدماً في إعداد جهاز الفيزيولوجيا الكهربائية. قم بتوصيل أي عدسة عينية لمجهر التشريح بمصدر ضوء LED أزرق مزود بمشتت حراري.

استخدم حاملًا ومشبكًا لتثبيت قاعدة مغناطيسية بالعدسة العينية ومصدر ضوء LED. ضع القاعدة المغناطيسية على طاولة الهواء الخاصة بجهاز الفيزيولوجيا الكهربائية. بعد ذلك، صِل مصدر الضوء بدائرة تحكم، ثم صِل دائرة التحكم بمصدر جهد خارجي.

نستخدم مخرج الجهد الكهربائي من نظام الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربائية PowerLab المصنع من قبل شركة ADInstruments. بمجرد التوصيل بمصدر الجهد، يتم إعطاء نبضات تتراوح بين 1 إلى 5 فولت للدائرة التحكمية من أجل تفعيل الضوء الأزرق، ثم يتم ضبط القاعدة المغناطيسية ومصدر الضوء حتى يتم تركيز حزمة الضوء الأزرق على المنطقة التي سيتم فيها تشريح اليرقة. بعد إجراء الضبط المناسب، نصبح مستعدين للانتقال إلى عملية تشريح اليرقة.

لبدء عملية التشريح، ضع ستة دبابيس بقطر 0.1 مليمتر في قاع طبق مبطن بـ agar. استخرج يرقات في المرحلة الثالثة من التطور النجمي من الوسط الغذائي وضعها في أي طبق بتري بلاستيكي. اشطف اليرقات بمحلول ملحي لإزالة أي بقايا طعام ملتصقة بها.

ثم يتم وضع اليرقات في طبق التشريح بالقرب من الدبابيس المسحوبة وملء الطبق حتى منتصفه بالمحلول الملحي. الآن، قم بتوجيه اليرقات بحيث تتمكن من رؤية أنبوبين فضيين يمتدان على طول السطح الظهري للحيوان. هذان الأنبوبان الفضيان هما القصبات الهوائية.

أدخل دبوساً كبيراً مباشرة في الذيل بين الأنابيب الرغامية. ثبّت اليرقات لأسفل وأدخل دبوساً كبيراً ثانياً في رأسها. تأكد من تمديد الجسم طولياً أثناء إدخال الدبوس.

استخدم المقص لعمل شق صغير بالقرب من الذيل. استمر في إجراء الشق على طول الجسم. تأكد من رفع أطراف المقص لتجنب قطع الأعصاب البطنية و/أو عضلات جدار الجسم.

ضع أربعة دبابيس على الزوايا الأربع للحيوان. الآن افتح المنطقة الوسطى. قم بتثبيت الدبابيس في طبق التشريح بحيث يتم بسط الحيوان بشكل مسطح.

قم بتثبيت العينة بحيث يتم التعامل معها باستخدام الملاقط والمقص. قم بإزالة الأعضاء الهضمية، والرغامي، والأجسام الدهنية للحيوان. اشطف العينة بمحلول ملحي.

بعد الشطف، حدد موقع الفصوص الجبهية والعقدة البطنية في العينة باستخدام مقصات دقيقة. اقطع العقدة البطنية بعناية خلف الفصوص الجبهية مباشرةً. بمجرد اكتمال عملية التشريح، ابدأ في عملية التحفيز بالضوء الأزرق وتسجيل نشاط العضلات.

لإجراء تسجيل العضلات، اسحب قطبًا كهربائيًا بمقاومة تتراوح بين 10 إلى 20 ميجا أوم. وباستخدام ساحبة أقطاب إلكترونية، املأ القطب المسحوب بمحلول KCl بتركيز 3 مولار. ضع القطب المملوء في حامل الأقطاب.

ضع الآن تحضير اليرقة تحت مجهر تشريحي على الحامل. اضبط الضوء الأزرق بحيث يكون التحضير المُشرح متمركزاً في حزمة الضوء. حدد العضلة السادسة أو M six في أي قطعة من جدار جسم اليرقة، وباستخدام مناول دقيق، أدخل القطب الكهربائي بعناية في M six وراقب حدوث فرط استقطاب عضلي سريع.

يجب أن تتراوح جهود الغشاء في حالة الراحة بين -30 millivolts و -70 millivolts. وبمجرد إدخال القطب الكهربائي بشكل صحيح، قم بتطبيق نبضات جهد تتراوح بين 20 إلى 100 millisecond على دائرة التحكم. زد الجهد الموفر لدائرة التحكم تدريجياً.

راقب جهود الوصلة الاستثارية في الخلية العضلية. تظهر هنا نتيجة نموذجية توضح جهد وصلة استثارية تم استحثاثه بواسطة نبضات ضوئية قصيرة. إن سعة جهد الوصلة الاستثارية الموضحة هنا هي السعة الإجمالية الناتجة عن عصبونين حركيين يُعرف أن كليهما يقوم بالتنشيط.

المقطع السادس. يمكن أن تؤدي شدة الضوء المنخفضة أو فترات التعرض الأقصر إلى إظهار جهد الوصلة الاستثاري ذو السعة الأصغر الناتج عن عصبون حركي واحد. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تحفيز للجهود التشابكية عند الوصلة العصبية العضلية في مادة oph عبر طريق القناة في غياب الوساطة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم إتلاف جدار الجسم في العينة أثناء عملية التشريح. كما ينبغي مراعاة أنه على الرغم من احتمال حدوث فرط استثارة في العينة مباشرة بعد التشريح، إلا أنها ستستقر بمرور الوقت، مما يسمح بالحصول على تسجيلات جيدة. وعند غرس الإبر في العضلات، يجب الحذر من النفاذ إلى ما تحت الطبقة العضلية الأولى وصولاً إلى جدار الجسم.

عندما يكون القطب الكهربائي عالقاً في جدار الجسم، قد تتمكن أحياناً من الحصول على جهود مفرطة الاستقطاب ولكن دون أن تكون بالفعل داخل خلية عضلية. هذا كل ما في الأمر.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.