المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

حسنًا، إن ما يميز مقايسة TEER حقًا هو أنها تتيح لك التصوير المباشر للخلايا التائية النوعية للمستضد. إن TEER هي الجانب الفريد الرئيسي في مقايستنا، وهي مقترنة بخطوة تضخيم نقوم بتنفيذها.

كما تعلمون، نقوم بعزل الخلايا التائية ثم ننميها في بيئة تعمل على إثراء العينة بالخلايا التائية التي تهمنا. بعد ذلك، نتمكن من وسم تلك الخلايا تحديدًا وتصويرها باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. وبالنسبة للمقاييس السابقة، مثل CFSE أو مقاييس التكاثر التي استُخدمت لعقود، فإن ما نحصل عليه هو مجرد قياسات إجمالية عامة لما يحدث في مجموعة الخلايا التائية بأكملها.

ولكن، يوجد الملايين من الخلايا التائية (T cells) في الجسم، وهي تتعرف على مجموعة متنوعة وشاملة من الأنماط. وإذا كنت محظوظاً، فقد تكون خلية واحدة من بين كل 200,000 إلى 300,000 خلية في العينة هي تلك التي تبحث عنها. وهذا هو السبب في أن هذا المقايسة تتضمن خطوات الإثراء هذه.

وبعد ذلك، ومع رقم اختبار معين، وبما أنك تقوم بالتلوين المباشر، يمكنك في الواقع تصور مجموعة خلوية تمثل أقل من 1% من إجمالي عدد الخلايا بعيداً عن الخلفية. وبذلك، يمكنك رصد فروقات صغيرة جداً والحصول على تعداد دقيق إلى حد ما لعدد الخلايا التائية الموجودة في عينة الدم تلك، أو لدى ذلك الفرد، والتي تتعرف على النمط المستهدف. ولا يتوقف الأمر عند هذا الحد، لأن الـ teters تسمح لك ليس فقط بتمييز تلك الخلايا التائية، بل بعزلها أيضاً لإجراء المزيد من التحليلات.

والتيتيرز (teters) التي تستخدمونها يتم تصنيعها فعلياً هنا في معهد BRI، هل هذا صحيح؟ نعم. نحن واحد من عدد قليل جداً من المختبرات في البلاد التي نجحت في تصنيع تيتيرز من الفئة الثانية. هدفنا هو توزيع هذه الكواشف بالتكلفة على أي مختبرات مهتمة باستيراد هذه التقنية.

ما الذي يمكن اعتباره الجوانب الأكثر صعوبة أو تحدياً في هذا المقايسة عند محاولة تكرارها في مختبرات أخرى؟ حسناً، بينما أفكر في الأمر، هناك جانبان في الواقع، وهما نمو الخلايا T. إن هذا الأمر بمثابة فن إلى حد ما.

ستتخذ قرارات بشكل يومائي تقريباً بشأن ما إذا كانت الخلايا بحاجة إلى مغذيات إضافية أو مساحة إضافية للنمو. أما الجزء الثاني، والذي أعتقد أنه الأكثر صعوبة بالنسبة للمشغل غير المتمرس، فهو تحليل البيانات؛ أي تحديد أي جزء من الإشارة يمثل استجابة إيجابية فعلية مقابل الجزء الذي يعود ببساطة إلى الفيزياء والجاذبية.

إن حقيقة أن كل شيء يمتلك درجة معينة من اللزوجة هي أمر يتطلب بدوره الكثير من الخبرة، خاصة في السياقات التي تكون فيها الاستجابة الإجمالية ضعيفة نوعاً ما. كيف يمكن للمعلومات التي ستولدها هذه المقايسة أن تفيد المرضى في هذه المرحلة؟ إن إحدى أولى العلامات التي تظهر لدى أي مريض يعاني من مرض مناعي ذاتي هي عبارة عن مجموعة من الأجسام المضادة النوعية لذلك المرض.

نعلم من المبادئ الأساسية لعلم المناعة أنه أينما كان هناك استجابة للأجسام المضادة، تكون هناك دائماً استجابة للخلايا التائية أولاً. ولذلك، إذا تمكنا من فحص الأشخاص المعرضين للخطر وملاحظة هذه القفزة في نشاط الخلايا التائية التي تسبق تكوين الأجسام المضادة، فإن ذلك سيساعدنا في تحديد مستوى جديد من المخاطر أو تحديد الأفراد الذين يتجهون نحو تكوين أجسام مضادة ذاتية، وهو ما قد يفتح نافذة للعلاجات التدخلية. ستقوم هذه العملية بتنقية وتوسيع الخلايا التائية CD4 الموجبة النوعية للمستضد وتصورها باستخدام كواشف ومعدات teters وخزانات السلامة البيولوجية ذات التدفق الصفائحي من الفئة الثانية.

ستكون هذه هي مساحة العمل الرئيسية للإجراء. أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter كأنابيب أساسية لعزل PBMC، ومحلول XPBS. يجب أن يكون هذا المحلول خالياً من الكالسيوم والمغنيسيوم، ومغلفاً بورق القصدير لحمايته من الضوء، مع جهاز مساعد الماصة (pipette aid)، وأنابيب CoStar سعة 10 mil مع إدخالات سعة 50 mil لمنع تلوث جهاز الطرد المركزي بالدم.

ماصات نقل طاردة مركزية GS six R، وماصات باستور، ومحلول منظم لترحيق الدم يحتوي على 8.3 grams per liter من كلوريد الأمونيوم و 1.0 grams per liter من بيكربونات الصوديوم و 0.04 grams per liter من EDTA الصوديوم منزوع الأيونات، ومحلول تريبان الأزرق بتركيز 0.2% في PBS، ومقياس كرات الدم (CYTOMETER)، وأنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، ومحلول تشغيل منظم يحتوي على PBS مدعم بـ two millimolar من EDTA بالإضافة إلى five grams per liter.

تم شراء مجموعة عزل BSA max CD four isolation kit two من شركة Milin biotech، وتم شراء القالب المغناطيسي EP magnet block من شركة stem cell technologies. ويمكن استخدام منصات إثراء الخلايا المغناطيسية الأخرى بنفس الفعالية. أنبوب بولي بروبيلين سعة 5 milliliter، ووسط RPMI 1640 مضاف إليه 25 millimolar hippies لتحضير وسط الخلايا التائية T-cell medium، ومصل بشري مجمع لاستكمال وسط الخلايا التائية T-cell medium، وpen strip لاستكمال وسط الخلايا التائية T-cell medium، ومرشح علوي للزجاجة بمسامية 0.22 micron وسعة 500 milliliters، وصفيحة معقمة ذات 48 بئراً تُستخدم للاستنبات التوسيعي في المختبر in vitro expansion culture، وحاضنة CO2 بدرجة حرارة 37 degree، ومحلول بتركيز 20 milligram per milliliter من ببتيد اصطناعي يحتوي على الإبيتوب (epitope) المستهدف.

استُخدمت أنابيب بولي ستيرين سعة خمسة ملليلتر من نوع fax tube peptide loaded class two teer لتصوير الخلايا التائية النوعية للمستضد، واستُخدمت أجسام مضادة من نوع anti CD three و anti CD four و anti CD 25 لطلاء الخلايا التائية النوعية للمستضد. جهاز قياس التدفق الخلوي Fax caliber flow cytometer أو ما يعادله؛ قبل البدء في الإجراء، قم بتجميع كافة المواد والمعدات في مساحة العمل الخاصة بك.

سيتناول العرض التوضيحي التالي الخطوات التالية: عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، وفصل الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، والزراعة التوسعية في المختبر، وتصوير الخلايا التائية بواسطة TEM أو الصبغ. الخطوة الأولى: عزل PBMC.

احصل على عينة دم. يجب جمع الدم في محاقن أو أنابيب جمع الدم ومعالجته بمضاد للتجلط وهو الهيبارين بنسبة 1 إلى 50 لمنع التجلط، مع توقع الحصول على عائد يبلغ حوالي 1 مليون PBMC لكل ملليلتر من الدم، والتي سيكون حوالي 40% منها عبارة عن خلايا T موجبة لـ CD four.

قم بتقسيم الدم إلى أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. 25 milliliters من الدم لكل أنبوب. اخلط الدم بلطف قبل عملية تخثر ALI لتوزيع البلازما.

أضف PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 40 milliliters، وقم بالتغطية السفلية عن طريق تجفيف 11 milliliters من القارورة وإدخالها في أنبوب الدم مع إزالة مساعد الماصة بعناية من الماصة. ستفرغ القارورة ببطء في قاع الأنبوب. وبمجرد تعادل المستوى، قم بإزالة الماصة ببطء من أنبوب الدم وتخلص من الأغطية وأغلق أنابيب الدم ثم انقلها إلى عبوات الرذاذ.

أغلق العبوات بإحكام ثم قم بالطرد المركزي عند 900 ×g لمدة 20 دقيقة دون استخدام المكبح. من الضروري عدم تطبيق قوة الكبح في نهاية هذه الدورة لأن قوة الكبح ستؤدي إلى تعكير طبقة الخلايا بعد الطرد المركزي. يجب أن تشكل pbmc طبقة بيضاء متميزة بين البلازما الصفراء في الأعلى والطبقة الشفافة في الأسفل.

قم بإزالة طبقة خلايا الدم البيضاء برفق باستخدام ماصة نقل وانقلها إلى أنبوب جديد. قد يتم سحب بعض البلازما والفيبرين مع خلايا PBMC، ولكن تجنب سحب أي جزء من طبقة الخلايا الحمراء. عادةً ما يمكن دمج أنبوبي دم في أنبوب خلوي واحد في هذه الخطوة.

لزيادة حجم الراسب، أضف PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 ×g لمدة 15 دقيقة مع ضبط كبح السرعة على الوضع المنخفض وتفعيل ميزة منع الرذاذ في الأنابيب، ثم اسحب السائل باستخدام ماصة باست، مع الحرص على عدم تعكير الراسب. عالج العينات باستخدام محلول التحلل الدموي بإضافة خمس إلى ستة milliliters إلى كل أنبوب والمزج برفق لإزالة التكتلات. قم بالتحضين لمدة لا تزيد عن خمس دقائق.

أضف محلول PBS حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 50 milliliters وقم بالطرد المركزي عند 230 ×g لمدة 10 دقائق. عند استخدام قوة كبح منخفضة، لم تعد عبوات الرذاذ ضرورية لعمليات الطرد المركزي البطيئة هذه. اغسل الخليط مرتين عن طريق سحب السائل باستخدام ماصة باستير مملوءة بمحلول PBS، ثم قم بالطرد المركزي عند 230 ×g لمدة 10 دقائق قبل خطوة الغسل النهائية، ثم خذ عينة من الخلايا المعاد تعليقها، وخففها باستخدام trypan blue وقم بعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).

سيحدد عدد الخلايا هذا أحجام الكواشف المستخدمة في فصل الخلايا التائية. الخطوة الثانية، فصل الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، يتم سحب السائل وإضافة محلول التشغيل المنظم (running buffer) لرفع الحجم الإجمالي إلى 40 µL لكل 10 مليون خلية. يتطلب هذا عادةً 30 µL من المحلول المنظم بالإضافة إلى حجم الراسب المتبقي.

انقل هذا الحجم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. أضف مزيج الأجسام المضادة من أطقم عزل CD four، بمعدل 10 microliters لكل 10 million cells، ثم أغلق الأنبوب وضعه على الثلج لمدة 10 minutes. أخرج الأنبوب من الثلج، وانزع الغطاء، وأضف 30 microliters من محلول التشغيل المنظم (running buffer) لكل 10 million cells.

أضف حبيبات مغناطيسية من طقم عزل CD four، بمعدل 20 µL لكل 10 مليون خلية، ثم غطِّ الأنبوب وضعه على الثلج لمدة 15 دقيقة. أضف 10 أحجام من محلول التشغيل المنظم (running buffer) للغسل، ثم قم بالطرد المركزي عند 230 ×g لمدة 10 دقائق.

أثناء عملية الطرد المركزي، قم بتجهيز المغناطيس وأنبوب البولي بروبيلين سعة 5 mL في مساحة العمل الخاصة بك. اسحب السائل من كريات الخلايا. أضف 2 mL من محلول التشغيل المنظم (running buffer) وأزل التكتلات باستخدام ماصة نقل.

باستخدام نفس الماصة التحويلية، انقُل الخلايا إلى أنبوب سعة 5 mL وحضّنها في المغناطيس لمدة 15 دقيقة. قم بتفريغ كسر الخلايا التائية الإيجابية لـ CD4 بعناية في أنبوب سعة 15 mL مُعلم عن طريق قلب المغناطيس وإفراغ جميع السوائل باستثناء القطرة الأخيرة. أضف 2 mL أخرى من محلول التخزين المنظم (running buffer) إلى أنبوب الـ 5 mL ثم أخرجه من المغناطيس.

اشطف بلطف الخلايا السالبة CD4 من جوانب الأنبوب وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل مُعلم. أضف ملليلترين من وسط زراعة الخلايا التائية (T-cell medium) إلى كل أنبوب. خذ عينات لعد الخلايا ثم قم بالطرد المركزي عند 230 ×g لمدة 10 دقائق.

قم بتخفيف حصص الخلايا باستخدام صبغة tripan blue وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). ستحدد تعدادات الخلايا هذه عدد الآبار المستخدمة في استزراع التوسع. الخطوة الثالثة.

في عملية التوسيع المختبري، اسحب السائل الطافي من كتل الخلايا الموجبة لـ CD4 والخلايا السالبة لـ CD4 بناءً على تعداد الخلايا. أضف الوسط الغذائي إلى الخلايا الموجبة لـ CD4 لضبط الحجم ليصبح 3 مليون خلية لكل mil. أضف الوسط الغذائي إلى الخلايا السالبة لـ CD4 لضبط الحجم ليصبح 10 مليون خلية لكل mil.

تتطلب زراعة التوسع 3 ملايين من الخلايا السلبية لـ CD4 لكل بئر، ومن 2 إلى 3 ملايين من الخلايا الإيجابية لـ CD4 لكل بئر. وعادةً ما تكون الخلايا الإيجابية لـ CD4 هي المجموعة المحدودة. قم بتوزيع حصص من الخلايا السلبية لـ CD4 في العدد المناسب من الآبار في طبق يحتوي على 48 بئراً.

بعد إضافة 300 µL إلى كل بئر، ضع الطبق في حضانة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. أخرج الطبق من الحضانة، ثم اغسل الآبار بإضافة 500 µL من وسط غذائي جديد، مع السحب والضخ برفق باستخدام ماصة نقل من 12 إلى 20 مرة، ثم قم بإزالة السائل بالكامل. ستترك عملية الغسل هذه طبقة من الخلايا المقدمة للمستضد الملتصقة.

عند اكتمال عملية الغسل، أضف كمية كافية من الوسط الغذائي لترطيب قاع كل بئر، حوالي 100 microliters. وإلا فإن الخلايا الملتصقة ستجف. أضف من 2 إلى 3 مليون من خلايا CD4 positive إلى كل بئر إذا لزم الأمر.

أضف وسطاً إضافياً لرفع الحجم الإجمالي في كل بئر إلى 1 مل. أضف الببتيد المطلوب إلى كل بئر. يكون التركيز النموذجي للتحفيز 10 µg/mL.

أخيرًا، ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C لمدة سبعة أيام. بعد مرور سبعة أيام، أضف 50 µL من hemo IL two إلى كل بئر في كل يوم تالٍ.

راقب نمو الخلايا باستخدام المجهر؛ وبالنسبة للآبار التي لم تصل بعد إلى مرحلة الالتحام، قم بإزالة نصف الوسط الغذائي وإضافة وسط غذائي جديد و50 µL من IL-2. أما بالنسبة للآبار الملتحمة، فقم بتقسيمها عن طريق إعادة تعليق الخلايا ونقل نصفها إلى بئر فارغ، ثم أضف وسطاً غذائياً جديداً و50 µL من IL-2. أعِد الخلايا إلى الحاضنة. ستكون الخلايا المتكاثرة جاهزة لصبغة teer بعد 13 إلى 15 يوماً من الزراعة.

الخطوة الرابعة، تصوير الخلايا التائية عن طريق صبغ التيترا، قم بشراء أو تجميع التيترا لتتناسب مع تركيبات الببتيد و MHC المستخدمة لتحفيز الخلايا التائية الموجبة لـ CD4. قم بإخراج الطبق من الحاضنة.

اسحب نصف الوسط الغذائي بعناية من كل بئر. انقل عينة من الخلايا من كل بئر، عادةً 75 µL أو حوالي 50,000 خلية، إلى أنبوب فاكس بوليسترين سعة 5 mL، ثم أضف T-cell receptor (TCR) عادةً 1 µL لكل 50 µL من الحجم الإجمالي، وضعها في حضّانة بدرجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. يُنصح أيضاً بصبغ عينة ثانية من كل بئر باستخدام TCR غير مطابق كعينة تحكم سلبية. قم بتمييز الخلايا باستخدام أجسام مضادة لـ CD3 وCD4 وCD25.

يمكن استخدام واسمات أجسام مضادة إضافية أو بديلة. ومع ذلك، لا تستخدم الأجسام المضادة المسمى بـ PE لأن هذه القناة يجب أن تظل محجوزة للـ teems في الوقت الحالي. كما يجب وسم أي ضوابط ذات لون واحد أو ضوابط النمط الإسوي (isotype controls) باستخدام خلايا إضافية.

يتم تحضين الخلايا المحددة بالأجسام المضادة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. تُغسل كل أنبوبة باستخدام 0.5 إلى 1 مل من محلول الغسل (running buffer)، ثم تُطرد مركزياً عند 230 ×g لمدة 10 دقائق. يُسكب السائل بعناية من أنابيب الفاكس، ثم يُعاير جهاز قياس التدفق الخلوي باستخدام حبيبات مرجعية، وأنابيب تحكم أحادية اللون، وعناصر تحكم من النوع المتماثل (isotype controls)، وما إلى ذلك.

قم بتحليل كل أنبوبة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer). يجب أن تظهر الخلايا الموجبة للتيترا (tetra positive cells) كمجموعة متميزة من بين خلايا T الموجبة لـ CD4 التي تم توسيعها. عادة ما تكون الخلايا الموجبة للتيترا موجبة لـ CD25 وغالبًا ما تكون ذات تعبير عالٍ لـ CD4.