تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع

من خلال الجمع بين التهجين الموضعي وصبغ رباعي القسيمات في تقنية تُعرف باسم ISTH، يمكن تحديد الأعداد النسبية والعلاقات المكانية بين الخلايا المناعية المؤثرة النوعية للمستضد الفيروسي والخلايا والأنسجة المصابة فيروسياً. تبدأ عملية ISTH بتضمين نسيج مصاب بـ SIV حديث في agarose. يتم تقطيع النسيج إلى مقاطع بسماكة 200 micron باستخدام vibratome وتصبغ للكشف عن المستضد الفيروسي.

خلايا CD8 موجبة محددة باستخدام رباعيات MHC الموُسمة بـ FITC. بعد التجميد، يتم تقطيع هذه المقاطع المصبوغة بشكل إضافي إلى مقاطع بسمك 8 µm باستخدام المجهر المبرد (cryostat)، ثم يُجرى التهجين الموضعي (in situ hybridization) لتحديد مواقع الخلايا المصابة فيروسياً. ويُستخدم المجهر البؤري (Confocal microscopy) لتصوير المقاطع المصبوغة المزدوجة، ومن ثم إعادة بناء المقاطع السميكة الأصلية للكشف عن العلاقة بين الخلايا المؤثرة المناعية والخلايا المستهدفة.

لقد أثبت استخدام هذا الإجراء لفحص عدوى SIV المبكرة أنه مؤشر جيد لشدة المرض الذي يليه. مرحباً، أنا Chinen Lee من مختبر Ashley HA في قسم الميكروبيولوجيا بجامعة Minnesota. أنا Pam Skinner، أستاذ مساعد في قسم العلوم الطبية البيطرية بجامعة Minnesota.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتهجين الموضعي أو ISTH باختصار. بالإضافة إلى استخدام صبغ التيترايمر الموضعي مدمجاً مع التهجين الموضعي كما سنوضح اليوم، فإننا نستخدم بشكل روتيني أيضاً صبغ التيترايمر الموضعي مدمجاً مع الكيمياء النسيجية المناعية لتحديد الموقع والوفرة ومظهر التعبير البروتيني لخلايا CD8 T النوعية للمستضد في الموقع. سيساعدنا اليوم في صبغ التيترايمر الموضعي للمقاطع السميكة كل من د. Heon Kim وTerry Matala، بينما ستساعدنا So في تحضير المقاطع الرقيقة والتهجين الموضعي. دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء، قم بتبريد حمام Vibram الذي يحتوي على PBSH معقم إلى درجتين Celsius. اضبط زاوية شفرة الهزاز على 27 درجة. كلما أمكن ذلك، حافظ على تبريد الأنسجة الطازجة على الثلج، وابدأ الإجراء في غضون 24 ساعة من حصاد الأنسجة.

من أجل تقليل التحلل الناتج عن التبريد، يسهل الجهاز أيضاً تقطيع نسيج حديث، وإزالة النسيج الضام، وتقطيع العينة باستخدام المشرط إلى قطع صغيرة ووضع القطع في وعاء نقل (whey boat) وتغطيتها بـ 4%low melt. Agros في PBS مُذاب عند حوالي 40 درجة Celsius. تأكد من ملامسة النسيج لقاع الطبق وادفع قطع النسيج للأسفل إذا كانت تطفو، ثم اتركها تتصلب على الثلج لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

يتم هنا استخدام أنسجة الطحال، ولكن يمكن أيضاً استخدام العقد اللمفاوية، أو المهبل، أو عنق الرحم، أو الرحم، أو أي أنسجة طازجة أخرى باستخدام المشرط. قم بقطع الأجراس حول النسيج، وباستخدام الملاقط، انقل النسيج المدمج في الأجراس بعناية إلى كتلة الأنسجة. استمر في تغطية كتلة أنسجة Vibram باستخدام غراء Loctite.

لا تحرك قطعة النسيج بمجرد وضعها على كتلة النسيج. اتركها لتجف لمدة 10 دقائق تقريباً على الثلج. بعد ذلك، قم بتثبيت كتلة النسيج في جهاز القطع الاهتزازي (vibrator) وقطع النسيج إلى مقاطع بسمك 200 micrometer باستخدام سرعة أمامية بطيئة جداً وسعة اهتزاز عالية نسبياً.

استخدم فرشاة رسم لنقل القطاعات المقطوعة إلى غرفة أنسجة متخصصة موضوعة في بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 24 بئرًا، والمعبأة مسبقًا بـ 1 mL من PBSH المبرد. ضع ما يصل إلى أربعة قطاعات نسيجية في كل غرفة أنسجة. قم بتمييز العينات وثبّت غطاء الطبق برباط مطاطي من أجل صبغ القطاعات النسيجية للبحث عن الخلايا التائية النوعية للفيروس.

يتم أولاً تخفيف رباعيات ZI المتقارنة في محلول حجب ليكون تركيزها 0.5 micrograms per milliliter. يتم سحب المحلول بواسطة الماصة ووضعه في طبق يحتوي على 24 بئراً بمعدل one milliliter لكل بئر. تُنقل الأنسجة المقطوعة حديثاً إلى الطبق في غرف الأنسجة، وتُترك لتتأرجح طوال الليل عند درجة حرارة four degrees Celsius.

اترك بئراً فارغة بين غرف الأنسجة التي تحتوي على عينات مختلفة لمنع التلوث الخلطي للمحاليل في الخطوات اللاحقة. في هذه الخطوة، يمكن إضافة أجسام مضادة موجهة ضد البروتينات خارج الخلوية أو بروتينات سطح الخلية. ولعملية الغسل، قم بتجهيز طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً يحتوي على PBSH مبرد بعد فترة الحضانة الأولية.

تُغسل العينات مرتين عن طريق نقل غرف الأنسجة إلى طبق مملوء مسبقاً لمدة 20 دقيقة في كل مرة، مع التأكد من تصريف معظم السوائل من غرف الأنسجة قبل النقل. كما يجب الحرص على عدم تنقيط محتويات عينة في عينة أخرى عند نقل غرف الأنسجة، ومراقبة المقاطع الموجودة في غرف الأنسجة للتأكد من عدم التصاقها بالجوانب. يتم تثبيت المقاطع باستخدام 4%paraldehyde طازج في PBS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بعد التثبيت.

تُغسل الشريحة مرتين بـ PBSH البارد لمدة خمس دقائق في كل مرة لتعزيز الإشارة الناتجة عن التترايمرات. تُحضن المقاطع مع أجسام مضادة من الأرانب مضادة لـ fitzy بنسبة 1 إلى 10,000 في محلول الحجب لمدة تتراوح من يوم إلى ثلاثة أيام. وفي هذه المرحلة، يمكن إضافة أجسام مضادة ضد الحاتمات داخل الخلوية.

تأكد من نفاذية الخلايا وحجب المواقع غير النوعية قبل إضافة الجسم المضاد. قد يتطلب الأمر أيضاً استعادة المستضد بعد فترة التحضين الثانية الطويلة والمخصصة لتضخيم الإشارة. اغسل المقاطع في PBSH ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة على الأقل وتصل إلى عدة ساعات في كل مرة.

أجرِ تحضينًا نهائيًا باستخدام أجسام مضادة مناسبة وموسومة بفلوروفورات. على سبيل المثال، يمكن استخدام goat anti rabbit SI three لربط أجسام rabbit anti fitzy المضادة لجعل الخلايا المصبوغة بالتيترايمر تتألق باللون الأحمر. وفي حال استخدام أجسام مضادة من الفأر لصبغ بروتينات ذات أهمية مثل CD eight لتصور الخلايا التائية القاتلة، يمكن استخدام goat anti-US Alexa 488 للارتباط بالأجسام المضادة للفأر وجعل الخلايا المصبوغة بالأجسام المضادة تتألق باللون الأخضر؛ ويجب تحديد تخفيفات كل جسم مضاد تجريبيًا.

يتم التحضين لمدة تتراوح من يوم واحد إلى ثلاثة أيام، مع الحفاظ على المقاطع محمية من الضوء عن طريق لف الأطباق بورق القصدير أثناء هذه الفترة وبعدها، لأن الضوء يضعف الفلورية. وأخيراً، يتم تثبيت المقاطع مرة أخرى لتثبيت التتراميرات والأجسام المضادة في مكانها. تُغسل المقاطع وتُثبت على شريحة مجهرية باستخدام جيلاتين الجلسرول الذي يحتوي على 4 mg/mL من N profile gallate للتخزين عند -20 °C حتى تحضير المقاطع الرقيقة للتهجين الموضعي.

يمكن الآن تحليل مقاطع صبغة التترايمر في الموقع باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) لتحديد وفرة التموضع ونمط التعبير البروتيني للخلايا التائية CD8+ النوعية للمستضد. في الصورة الموضحة، تم صبغ مقاطع نسيج الطحال من ريزوس ماكاس مصاب بـ SIV باستخدام تترايمرات gag لوسم الخلايا التائية CD8+ النوعية لـ SIV، والأجسام المضادة CD20 والأجسام المضادة CD3. وبما أن الصبغة المضادة باستخدام الأجسام المضادة ستُفقد في الخطوة التالية، فمن المهم تحليل التترايمرات في الموقع قبل المتابعة.

ابدأ إجراء التقطيع الرقيق بتسخين المقاطع التي يبلغ سمكها 200 micron عند درجة حرارة 70 °C لمدة خمس دقائق على كتلة تسخين، وذلك لفصل المقاطع السميكة عن الشريحة. وبمجرد انفصال المقاطع، قم بتضمينها في OCT على الثلج الجاف عن طريق ملء قاع القالب البلاستيكي أولاً بـ OCT، ثم ضع النسيج فوق OCT وقم بتغطيته بـ OCT.

استخدم جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat) لقطع مقاطع بسمك ثمانية ميكرون من العينات المدمجة في مركب OCT، ثم ألصق هذه المقاطع ذات الثمانية ميكرون بشرائح زجاجية مطلية بالسيليكون. يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح عند درجة حرارة -80 °C في صندوق محكم الإغلاق لإجراء عملية التهجين الموضعي اللاحقة. يُستخدم التهجين الموضعي القياسي للكشف عن الخلايا المصابة بالفيروس عبر مجسات ريبوزومية (rib probes) خاصة بالفيروس وموسومة بـ S 35.

تتضمن العملية أيضاً طلاء المقاطع بمستحلب المسار النووي وتثبيت الشرائح. يتم الحصول على الصور البؤرية في وسط "باراماونت" متوافق مع الفلورة باستخدام مجهر بؤري من نوع BioRad MRC 1000، مجهز بجهاز انعكاس للأنبوب الأزرق فوقي (epi tube blue reflection device). يتم تصوير صبغة التيترا الموضعية باستخدام EPI one 605 للفلوروكروم التيترا الأحمر، وEPI 2 522 DF 32 للفلوروكروم الأخضر CD8 الخاص بالتهجين الموضعي.

استخدم انعكاس EPI الأزرق المزدوج لحبيبات الفضة الناتجة عن إشارة التهجين الموضعي في الصور الشعاعية المظهرة. لبدء عملية استحواذ الصور، قم بالتقاط الصور من كل مقطع من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل، مع التأكد من التقاط كل صورة بتداخل بنسبة 20% تقريباً مع الصور المجاورة لها. ولتجنب حدوث فجوات في الصورة المجمعة المعاد بناؤها، قم بتسمية كل صورة وفقاً للصف والعمود الخاص بها في ملف Excel.

عند اكتمال جمع البيانات من الشرائح، استخدم برنامج confocal assistant لإسقاط الصور المتسلسلة Z لكل قناة في صورة واحدة باستخدام إجراء Photoshop seven المتاح من المؤلفين، ودمج الصورة المسقطة من القنوات الثلاث تلقائياً في صورة RGB واحدة. بعد ذلك، قم بتجميع الصور المدمجة معاً في طبقات لإنشاء صورة مونتاج للمقطع بأكمله. اربط حبيبات الفضة الفردية وصبغة التترامير بالخلايا في المونتاج باستخدام metamorph أو Photoshop.

حدد إحداثيات XY للمراكز أو معرفات الكائنات (OIDs) للخلايا الموجبة للـ viral RNA والخلايا الموجبة للتترايمر. قم بتصدير بيانات الـ OID إلى ملفات Excel كأرقام عددية لكل خلية، واستخدم البيانات التي تم جمعها في ملفات Excel لتحديد نسب الخلايا المؤثرة المناعية أو خلايا e إلى الأهداف الفيروسية أو خلايا T من إجمالي أعداد الخلايا الموجبة للتترايمر والموجبة للـ viral RNA في المقطع لرصد العلاقات المكانية بين الخلايا الموجبة للتترايمر والموجبة للـ RNA. انسخ الرسوم البيانية الخاصة بها من ملفات Excel والصقها في مستند Photoshop في برنامج Photoshop.

قم بتقليل تعتيم إحدى الطبقات لمحاذاة وتغيير مقاس الشبكات بحيث تتطابق الألوان، ثم حددها، وبعد ذلك قم بنسخها ولصقها في طبقة جديدة. تخلص من الطبقة المستخدمة لمحاذاة الشبكات في مواضع الخلايا الزرقاء الموجبة لـ RNA، وستظهر مواضع الخلايا الموجبة للتيترا مير والموجبة لـ viral RNA في الصورة المسطحة. باستخدام طريقة ISTH الموضحة هنا، يمكننا تتبع الاستجابة المناعية لعدوى SIV بعد التلقيح المهبلي عند بوابة الدخول هذه وفي الأنسجة اللمفاوية التي تنتشر إليها العدوى.

توجد أعداد كبيرة من الخلايا المصابة في مواقع الأنسجة هذه بعد 10 أيام من الإصابة، ولكن حتى بعد مرور ثلاثة أيام، تظهر خلايا موجبة لـ CD A مصبوغة باللون الأخضر، ولكن لا تظهر بعد خلايا موجبة للتترا (tetra) الخاصة بـ SIV مصبوغة باللون الأحمر. وبالتالي، فإن الاستجابة المناعية تأتي متأخرة للغاية بحيث لا تتمكن من القضاء على العدوى.

ومع ذلك، بعد ثلاثة أسابيع من الإصابة، يظهر بوضوح انخفاض في الخلايا المصابة، خاصة عند بوابة الدخول. وقد استخدمنا تقنية ISTH لإظهار أن مدى هذا الانخفاض كان مرتبطاً بالتقارب المكاني والأعداد النسبية للخلايا المؤثرة المناعية الموجبة للتيترايمر مقارنة بالخلايا المستهدفة الموجبة لـ N-S-I-V-R-N-A، ونطلق على هذا نسبة E إلى T في الجسم الحي.

يمكن تصور العلاقات المكانية بسهولة باستخدام هذه الطريقة، حيث تظهر الخلايا المؤثرة باللون الأحمر والأهداف الفيروسية باللون الأزرق في هذه العقدة اللمفاوية المصابة. توجد العديد من الخلايا المؤثرة والخلايا المستهدفة في تقارب وثيق، وهناك مناطق تحيط فيها العديد من الخلايا المؤثرة بخلية واحدة إيجابية لـ S-I-V-R-N-A، بينما تقف خلية إيجابية لـ S-I-V-R-N-A بمفردها في مناطق أخرى. يتم حساب نسبة ETT ببساطة بمجرد تحديد مواقع الخلايا وتسجيل أعداد كل منها في ملف Excel.

يرتبط أفضل تحكم في العدوى الفيروسية بوجود فائض كبير من الخلايا المؤثرة الحمراء مقارنة بالأهداف الخضراء بنسبة 43 إلى واحد. وفي هذه الحالة، كانت نسب ETT في عنق الرحم والمهبل حيث بدأت العدوى أقل منها في العقد اللمفاوية. ويشير الارتباط الإيجابي بين نسب ETT المرتفعة وانخفاض الحمل الفيروسي من ذروته إلى أن الاستجابة المناعية الأكثر قوة عند بوابة الدخول تترجم إلى تحكم أفضل في العدوى.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية الكشف المتزامن عن خلايا CDAT النوعية للغاية وخلايا الإصابة الفيروسية في الموقع (in situ). تسمح لنا هذه التقنية بالتصور المتزامن للخلايا التائية النوعية للمستضد والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لتقييم اللقاحات القائمة على الخلايا التائية CD8+، وكذلك التفاعلات الأخرى بين المسببات المرضية والعائل غير المتعلقة باللقاحات عند إجراء هذا الإجراء.

من المهم الحفاظ على خلو جميع الكواشف من الـ RNase قبل البدء في عملية التهجين في الموقع. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.