تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

تبدأ هذه الإجراءات باستزراع سلالة الطعم في أوساط تحتوي على أحماض أمينية طبيعية في سلالة التحكم SLAC، واللايسين والأرجينين بنظائر ثقيلة. يتم خلط كميات متساوية من كلتا السلالتين وتحليلهما عن طريق الطحن والنيتروجين السائل. يتم ترسيب المستخلصات الخام أولاً بواسطة جهاز الطرد المركزي، ثم تصفيتها عن طريق الربط بخرز spheros. بعد ذلك، يتم ربط مستخلص الخلايا بخرز IgG.

يتم تحلل البروتينات المرتبطة بحبيبات IgG بواسطة البروتياز، ثم تُقطع وتُرسّب. وبذلك تصبح العينة جاهزة الآن للتحليل باستخدام مطياف الكتلة. مرحباً، أنا جيسي تشاو من مختبر لون في قسم بيولوجيا الخلية البيئية في معهد علوم الحياة بجامعة كولومبيا البريطانية.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتحليل البروتومي الكمي يسمى silak، مقترناً بالتنقية بالألفة. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة المعقدات البروتينية.

دعنا نبدأ؛ في هذا الإجراء، تحتوي سلالة الطعم على أحماض أمينية طبيعية، بينما تحتوي سلالة التحكم SLAC على لايسين وأرجينين بنظائر ثقيلة. للبدء، قم أولاً بتنمية لتر واحد من كل من سلالة الطعم وسلالة التحكم بشكل منفصل حتى تصل إلى القيمة الموضحة على شاشتك. بعد ذلك، صب المزرعة في أنابيب طرد مركزي Nalgene سعة 500 milliliter.

قم بموازنة الحمولة في أنابيب الترسيب عند 2,580 RCF، ثم تخلص من الوسط المزرعي وأعد تعليق الراسب باستخدام 50 milliliters من D H2O البارد أثناء نقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliters، ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً لترسيب الخلايا عند 3000 RCF. وفي هذه المرحلة، يمكنك تجميد الراسب عند درجة حرارة negative 80 °C.

من المهم تذكر مطابقة مزرعة السلالة الضابطة مع مزرعة السلالة الطُّعم بنسبة واحد إلى واحد بناءً على وزن الكريات الجافة. أعد تعليق كل كريّة خلوية في 10 milliliters من buffer NP 40 مع إضافة protease inhibitor cocktail بنسبة واحد إلى 2000. اخلط المزرعتين الخلويتين عن طريق سكب محتوى إحدى الأنابيب مباشرة في الأخرى.

لبدء عملية طحن الخلايا أولاً، صب النيتروجين السائل في الهاون المبرد مسبقاً واتركه ليتبخر تماماً. بعد ذلك، أضف 2 mL من الخلايا إلى الهاون. صب كمية من النيتروجين السائل لتجميد الخلايا.

اطحن الخلايا حتى تصبح مسحوقاً ناعماً. كرر هذه العملية حتى يتم طحن جميع الخلايا. تأكد من عدم السماح للخلايا بأن تذوب.

أضف النيتروجين السائل عند الضرورة. بعد ذلك، انقل المسحوق إلى دورق مبرد بالثلج واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة. وعندما تبدأ الحواف في الذوبان، أضف 20 milliliters من منظم NP 40 buffer مع PIC بنسبة 1 إلى 200 بعد اكتمال الذوبان.

انقل المستخلص الخام إلى أنابيب Nalgene سعة 40 milliliter وقم بطردها مركزياً بسرعة 16, 000 RPM باستخدام دوّارة Sovos SA 600 لمدة 30 دقيقة. وأثناء الانتظار، خذ 300 microliters من خرزات SROs two B واغسل الخرزات في 300 microliters من محلول NP 40 buffer ثلاث مرات. بعد ذلك، أعد تعليق الخرزات في 300 microliters من المحاليل المنظمة بحيث تكون في شكل ملاط بنسبة واحد إلى واحد.

الخطوة التالية هي التطهير المسبق لمحلول تحلل الخلايا. وللقيام بذلك، انقل أولاً الطافي إلى أنبوب جديد وأضف حبيبات Spheros two B. ثم قم بالتحضين على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة.

أثناء التحضين، خذ 300 µL من خرزات IgG SROs الست واغسل الخرزات في 300 µL من محلول NP 40 buffer ثلاث مرات. ثم أعد تعليق الخرزات في 300 µL من المحاليل المنظمة بحيث تكون في شكل معلق بنسبة واحد إلى واحد. بعد التحضين، قم بترسيب SROs.

ضع خرزتين في الأنبوب. انقل الطافي إلى أنبوب جديد. تذكر الاحتفاظ بجزء من محلول تحلل الخلايا لإجراء تحليل Western blotting لاحقاً.

ثم أضف حبيبات IgG. وزع المحتويات على أنبوبين لتحقيق ارتباط أكثر كفاءة، ثم قم بالتحضين على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة ساعتين. بعد التحضين، اجمع الحبيبات في عمود كروماتوغرافيا عند درجة حرارة 4 °C.

تأكد من حفظ جزء من الكسر غير المرتبط. اغسل الخرز باستخدام 10 milliliters من منظم NP 40.

بعد ذلك، اغسل الحبيبات باستخدام 3 mL من محلول TEVC المنظم. تذكر مجدداً حفظ جزء من الحبيبات.

سيعكس هذا كفاءة الارتباط لاستخلاص الخرز. أولاً، أضف 5 µL من A-C-T-E-V إلى 1 mL من منظم TEVC. أضف منظم TEVC إلى الخرز وقم بالمزج.

انقل المحتويات إلى أنبوبين EINOR سعة 1.5 milliliter لضمان خلط أكثر كفاءة، ثم قم بالتحضين على منصة دوارة في غرفة باردة طوال الليل. بعد ذلك، قم بطرد الخرزات مركزياً لأسفل وانقل السائل الناضح إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter. اغسل الخرزات بـ 0.5 milliliters إضافية من منظم TEVC بعد الغسيل.

اجمع الأنابيب الثمانية في أنبوب واحد. يجب أن يكون لديك إجمالي 1.5 milliliters من ELU eight. احفظ جزءاً من TEV Elu eight من أجل الترسيب.

اضبط العينات الموزعة لتصل إلى تركيز 25%TCA باستخدام TCA بتركيز مائة بالمائة. وللقيام بذلك، قسّم الـ 1.5 milliliter من LU eight إلى أنبوبين سعة كل منهما 750 microliters. أضف 250 microliters من 100%TCA إلى الأنبوب.

يجب أن يتحول المحلول إلى اللون الحليبي. بعد ذلك، ضعه على الثلج لمدة 30 دقيقة، مع رج الخليط باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex) بشكل دوري بعد فترة الحضن.

قم بالتدوير بالسرعة القصوى في جهاز طرد مركزي مكتبي في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. اغسل مرة واحدة باستخدام 500 µL من الأسيتون المبرد بالثلج والذي يحتوي على 0.05 normal من حمض الهيدروكلوريك. ثم قم بالتدوير لمدة خمس دقائق بالسرعة القصوى عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، اغسل العينة مرة واحدة باستخدام 500 µL من الأسيتون المبرد بالثلج، ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق بالسرعة القصوى عند درجة حرارة 4 °C. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة الأسيتون بعناية وتجفيف الراسب من أجل الصبغ بالفضة. أعد تعليق الراسب في 50 µL من منظم عينات SDS بتركيز 1x.

إذا كنت تخطط لاستخدام البروتين المترسب لتحليلات تعتمد على مطيافية الكتلة، فمن المستحسن الترسيب باستخدام الإيثانول. وللقيام بذلك، أضف أولاً 20 micrograms من الغليكوجين، ثم خفف العينات خمس مرات باستخدام إيثانول بتركيز 100% واضبط التركيز إلى 50 millimolar من بيكربونات الصوديوم باستخدام محلول مخزون بتركيز 2.5 molar عند pH 5.0. اخلط المحلول عن طريق قلب الأنبوب.

اتركه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وأخيرًا، قم بتقسيم المحتويات إلى أنبوبي إينور (einor). ثم قم بترسيب البروتين المترسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 12,000 GS في درجة حرارة الغرفة.

يجب أن تشمل العينة المحفوظة خلال إجراء التنقية كلًا من مستخلص الخلايا المُنقى مسبقًا، والكسر المرتبط، والكسر غير المرتبط، والكسر المستخلص. نوصي بتحليل محتويات البروتين في العينات المذكورة أعلاه عن طريق لطخة ويسترن باستخدام الجسم المضاد Antit TAP أو الصبغ الفضي لبيان كفاءة الارتباط والاستخلاص في التجربة. في هلام الصبغ الفضي هذا، تم تصور بروتين SCS two tap المنقى مع الشركاء المتفاعلين معه ومقارنتهم بعينة ضابطة غير موسومة في لطخة ويسترن هذه.

تم تحليل أجزاء مختلفة تم جمعها أثناء تنقية SCS two tap عن طريق تقنية Western blotting باستخدام أجسام مضادة لـ tap. يُلاحظ أن SCS two tap قد هاجر عند وزن جزيئي أقل بعد الاسترداد عن طريق قطع إنزيم TEV protease، ولم يتبقَّ أي SCS two tap على حبيبات IgG بعد الاسترداد. وقد أكد ذلك أن عملية التنقية كانت عالية الكفاءة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنقية المعقدات البروتينية عن طريق التنقية بالألفة باستخدام حبيبات IgG. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة مطابقة السلالة الأساسية والسلالة الضابطة من حيث وزن الكريات الجافة قبل البدء في عملية التنقية. وبما أن تقنية LAC توفر لنا قياسات غير منحازة وكمية لشركاء الارتباط البروتيني، فإننا نكتفي بتنفيذ المرحلة الأولى من تنقية tap لتقليل فقدان العينات.

إذا لاحظت حدوث كميات كبيرة من الارتباط غير النوعي، فقد ترغب في تنفيذ البروتوكول كاملاً، والذي يمكن العثور عليه في دليل cold springing harbor. هذا كل شيء. شكراً للمتابعة وبالتوفيق في تجاربكم.

مهلاً، هيا يا مارك. آه، اذهب.