التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

الهدف الشامل لهذا الإجراء هو تحديد تفاعلات البروتين والبروتين داخل بروتين معين بطريقة موازية غير متحيزة ، وهو أمر غير ممكن مع التقنيات الأخرى. يتم تحقيق ذلك عن طريق التهجين الأول والبروتين المميز بالحاتمة ذات الأهمية مع مكتبة بروتين وظيفية عالية النقاء وكاملة الطول مودعة في مستوى إحداثيات على سطح شريحة المجهر. بمجرد أن يصل البروتين إلى التوازن مع كل بروتين من البروتينات المستهدفة الخاصة به على المصفوفة ، يتم غسل الجزء غير المرتبط ويتم الكشف عن تفاعلات البروتين بجسم مضاد أحادي النسيلة للحاتمة المترافقة مع جزء فلوري باستخدام ماسح ضوئي قياسي للمصفوفات الدقيقة.

تتشابك الصور الناتجة مع المعلومات المتعلقة بكثافة كل ميزة فيما يتعلق بالبروتين المرتبط وإشارة الفلورسنت. يتم استقراء هذه المعلومات بمساعدة برنامج تحليل المصفوفات الدقيقة لإنشاء قائمة بقيم الكثافة لكل ميزة على المصفوفة. يمكن تصدير المعلومات المتعلقة بالزوج المتفاعل بين البروتين والبروتين إلى برنامج تحليل المعلوماتية الحيوية النهائية لتسجيل البيانات الخاصة بالميزة وتحديد تفاعلات البروتين البروتيني بين البروتين محل الاهتمام والبروتينات الموجودة على المصفوفة الدقيقة.

يتم تجميع بيانات شدة الإشارة الأولية على اثنين أو أكثر من المصفوفات الدقيقة للبروتين لحساب تباين الفحص بين وداخل الفحص ، ويتم تطبيع البيانات لتسجيل كل تفاعل. يولد الناتج قائمة مستهدفة من البروتينات المتفاعلة ، والتي يمكن استخدامها لتوجيه مزيد من الاستجواب لتفاعلات بروتين البروتين. في الجسم الحي تم تطوير المصفوفة الدقيقة للبروتين الوظيفي في مختبر مايكل سنايدر منذ أكثر من 15 عاما.

منذ ذلك الحين ، كان هناك العديد من التطبيقات الناجحة لهذه التكنولوجيا نظرا لتعدد استخداماتها ومقايسات البروتين الكيميائية الحيوية. تسهل هذه التقنية دراسة تفاعلات البروتين وشبكات الإشارات المعيارية ، بالإضافة إلى الاتصال البديل وشلالات الإشارات المعروفة سابقا لاستزراع وتنقية مجسات كيناز الاندماج V الخمسة تستخدم سلالة الخميرة المخططة حديثا Y 2 58 التي تحتوي على صفيحة بروتين اندماجية V خمسة ، والخميرة على اليوراسيل الاصطناعية الكاملة ، 2٪ أجار سكر العنب ، وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام من الثقافة المجمدة. تلقيح الثقافات البادئة من مستعمرة واحدة وتنمو بين عشية وضحاها في اليوراسيل الاصطناعية الكاملة.

2٪ سكر العنب على منصة اهتزاز أو عجلة عند 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 400 مل من اليوراسيل الاصطناعي الكامل. 2٪ مزرعة رافينوز مع ثقافة بداية كافية لتحقيق كثافة بصرية نهائية عند 600 نانومتر أو OD 600 من 0.1.

قم بزراعة اللقاحات إلى OD 600 من 0.6 ، ثم قم بتحفيز V خمسة انصهار كيناز على شكل تعبير عن طريق إضافة ما يكفي من مستخلص الخميرة ثلاثة ×. نغمة بيب مكملة ب 6٪ جالاكتوز لتخفيف وسائط الحث بعامل ثلاثة أو تركيز نهائي للجالاكتوز بنسبة 2٪ تحفيز الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة ست ساعات على منصة اهتزاز. استخدم قارورة إرلينماير سعة لترين لضمان التهوية المناسبة.

حصاد الخلايا عن طريق تدوير 400 مل من معلق الخلية عند 1000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 50 مل من المخزن المؤقت PBS المثلج البارد وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل الحبيبات مرة أخرى في محلول ملحي مخزن للفوسفات المثلج أو المخزن المؤقت A PBS وانقله إلى أنبوبين من الغطاء المفاجئ من أجل التحلل.

بعد تدوير الخلايا عند 20 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المخزن المؤقت بماصة وضع الأنابيب على الجليد. قم بتجميع الخلايا التي تحتوي على حبات زركونيا 0.5 ملم في حجم واحد إلى واحد من حبيبات الخلية للحبات إلى تحلل PBS ، العازلة. ثم قم بدوامة الخليط ثلاث مرات باستخدام منصة تحريض لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

جهاز الطرد المركزي المحلل عند 20،000 مرة ، G في جهاز صغير منضدية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المحللة المصفاة إلى أنبوب يحتوي على ما يقرب من 100 ميكرولتر من راتنج تقارب النيكل المغسول مسبقا واحتضانه على الجوز لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. لالتقاط الهيستامين ستة × الموسومة V خمسة بيليه بروتين الانصهار الراتنج باستخدام جهاز طرد مركزي منضدية لمدة خمس دقائق عند 1000 مرة G وأربع درجات مئوية بعد إزالة المادة الطافية.

اغسل الراتنج بمحلول غسيل لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية على المحول. كرر الغسيل مرتين أخريين باستخدام محلول غسيل طازج. قم بتخفيض البروتينات بحجمين 100 ميكرولتر من 200 ملي مولار.

أضف الجلسرين إلى التركيز النهائي 30٪ من العينات واحفظه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامه في الفحص. لاكتشاف التفاعلات. تمييع V خمسة فلورو أربعة الجسم المضاد المترافق إلى 260 نانوغرام لكل مليلتر في المسبار ، عازلة وخلط جيدا عن طريق الرج.

ثم قم بتخفيف مسبار بروتين الاندماج V على نطاق تركيز من خمسة إلى 500 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإزالة المصفوفات الدقيقة للبروتين من الفريزر وقم بإحضارها إلى أربع درجات مئوية في الثلاجة قبل الاستخدام مباشرة. أضف المخزن المؤقت للحجب مباشرة إلى حامل الشريحة الذي يحتوي على المصفوفات الدقيقة للبروتين وقم بتغطية الجزء العلوي بالنموذج لمنع التسرب.

قم بحظر المصفوفات في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة عن طريق الاهتزاز عند 50 RP على مرحلة عند أربع درجات مئوية. بعد الحظر ، انقل المصفوفات إلى غرفة مرطبة ، مبلطة إلى أربع درجات مئوية وأضف 90 ميكرولترا من المسبار المخفف مباشرة إلى سطح المصفوفة. قم بتراكب المصفوفات بزلة رافع مرتفعة واحتضانها دون اهتزاز في الغرفة المرطبة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة ونصف بعد الحضانة ، أضف الشريحة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على ما يكفي من عازلة المسبار المبردة مسبقا لتغليف الشريحة بالكامل ، مما يسمح لانزلاق الرافع بالانزلاق برفق من المصفوفة الدقيقة للبروتين.

اغسل المصفوفات ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة في ثلاثة أنابيب مخروطية الشكل. ضع محلول الجسم المضاد مباشرة على المصفوفة فور الانتهاء من الغسيل والتراكب مع انزلاق الرافع الممسوح. كما كان من قبل ، احتضن المصفوفات لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الغرفة المرطبة.

قم بإجراء نفس خطوة الغسيل كما كان من قبل ، وقم بالدوران في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر بمقدار 800 مرة G في جهاز طرد مركزي منضدي لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتجفيف المصفوفات بالهواء في حامل منزلق في الظلام لمدة 30 دقيقة قبل مسح المصفوفة بدقة 647 نانومتر. في هذه التجربة ، تم التحقيق في نشاط الربط ل TDA واحد V خمسة.

احتضان المصفوفات الدقيقة لبروتين الخميرة المرقطة في نسختين مع ما يقرب من 4،200 بروتين اندماج GST كامل الطول مع التحكم في النواقل الفارغة أو مع TDA واحد V خمسة مجسات. تقارن اللوحات الداخلية المنطقة المتطابقة في كلا المصفوفين. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى RIM 11 ، والذي تم تحديده أيضا بشكل مثير للاهتمام على أنه هدف فسفرة ل TDA في دراسة نشرت سابقا.

بمجرد تحديد الأهداف ، يمكن اختبارها للنشاط الكيميائي الحيوي والوظيفي في الجسم الحي. إذا كنت تشاهد هذا الفيديو ، فيجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية استخدام المصفوفات الدقيقة للبروتين الوظيفي كوسيلة لتحديد تفاعلات بروتين البروتين المرشح لمزيد من التحقق من الصحة والاستجواب في الجسم الحي.