إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

في هذا البروتوكول المرئي، ستتعلم كيفية فصل أنسجة رئة الفأر البالغة باستخدام gentle max بعد تفكيك أنسجة الرئة. وفي وجود collagenase d و DNAS one، يتم ترشيح المعلقات الخلوية باستخدام مصفاة خلايا بمسامية 70 micron، ثم تُجرى لها عملية طرد مركزي، وتُعلّق لاستخدامها في تطبيقات لاحقة. مرحباً، أنا ميلاني ملو من شركة Mil Biotech في ألمانيا.

سأعرض لكم اليوم إجراءً قابلاً للتكرار ومؤتمتاً لتحضير معلق خلوي أحادي من أنسجة رئة الفأر باستخدام تقنية GenX dissociation. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتحضير معلقات خلوية أحادية بغرض تحضير الكريات البيضاء أو الخلايا البطانية. حسناً، لنبدأ.

قبل البدء في البروتوكول، يجب تحضير بعض المحاليل القياسية وتجهيزها. أولاً، سنحتاج إلى محلول Hebes المنظم. ثانياً، محلول collagenase D يحتوي على 100 mg/mL من الإنزيم ومحلول Hebes المنظم.

ثالثاً، محلول dase one يحتوي على 20,000 وحدة لكل مليلتر من dase one. وأخيراً، محلولان منظمان شائعان: محلول PBS منظم تقليدي عند pH 7.2، ومحلول PEB منظم مشتق من محلول شطف AutoMax ومحلول BSA المخزون.

نبدأ البروتوكول برئة مستأصلة من فأرة تجارب أنثى تبلغ من العمر ستة إلى سبعة أسابيع. تأكد من خلو الرئة من الأعضاء المجاورة مثل القلب والغدة الزعترية، والأوعية الدموية الصادرة والواردة، والقصبة الهوائية والأنسجة الضامة. اغسل النسيج في طبق بتري يحتوي على PBS لإزالة كريات الدم الحمراء.

عادةً ما تزن رئة الفأر في هذا العمر ما بين 110 و 150 مليجرام. إذا كنت تخطط لتفكيك رئات من حيوانات أكبر سناً أو سلالات فئران أخرى، فقم بوزن النسيج والمحلول المنظم. يمكن تفكيك 450 مليجرام كحد أقصى من النسيج في الأنبوب الواحد.

انقل نسيج الرئة إلى أنبوبة gentle max C تحتوي على 4.9 milliliters من heis buffer. أضف 100 microliters من collagenase D solution بتركيز نهائي قدره two milligrams per milliliter إلى نسيج الرئة والمحلول المنظم. الآن أضف 10 microliters من dase.

محلول واحد لأكثر من 150 milligram من النسيج. أضف 20 µL من المحلول الأول. تأكد من إغلاق الأنبوب C بإحكام وضعه مقلوباً على جهاز gentle max dis.

تأكد من وضع النسيج بين الدوار والجزء الثابت. اختر برنامج الرئة وقم بتشغيله بالضغط على زر البدء، وعند انتهاء البرنامج، قم بإزالة الأنبوب C من الجهاز واحضن العينة لمدة 30 دقيقة.

أثناء التحضين في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C، يجب تدوير الأنبوب باستخدام جهاز تدوير الأنابيب max mix أو تدويره يدويًا كل خمس دقائق. بعد التحضين، أعد الأنبوب C إلى جهاز max Associator اللطيف وشغّل برنامج الرئة الثاني. وأثناء تشغيل البرنامج، قم بتجهيز أنبوب سعة 50 mL لجمع الخلايا المفلترة عن طريق استبدال الغطاء بمصفاة خلايا ذات مسام بحجم 70 µm. وبمجرد انتهاء برنامج التفكيك، وبناءً على توزيع مادة العينة في الأنبوب، قد ترغب في طرد الأنبوب مركزياً لفترة وجيزة لتركيز مادة العينة.

يمكن إزالة الخلايا المفككة من الأنبوب عن طريق السحب باستخدام الماصة عبر الغطاء المسدود بسدادة من الأنبوب C. وباستخدام طرف ماصة مناسب سعة 1000 µL، يتم وضع معلق الخلايا على مصفاة الخلايا لإزالة الجسيمات الكبيرة أو التجمعات. وبمجرد تصريف المحلول، تُغسل مصفاة الخلايا بإضافة خمسة mL إضافية من محلول hees buffer في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا المفلترة.

قم بطرد الأنبوب سعة 50 milliliter مركزياً عند 300 GS لمدة 10 دقائق. الآن، قم بسحب السائل الطافي وإعادة تعليق كتلة الخلايا في الحجم المطلوب من محلول PEB buffer بدرجة حرارة الغرفة.

لا تقم بسكب السائل الطافي. يمكنك الآن الانتقال إلى التطبيق اللاحق. إن تفكيك أنسجة الرئة للفئران باستخدام هذا الإجراء سيؤدي إلى الحصول على نسبة عالية من الكريات البيضاء والخلايا البطانية القابلة للحياة.

تم صبغ معلقات الخلايا المفردة المشتقة باستخدام CD 45 PE أو CD 1 46 FITC، أو CD 31 FITC، وحُللت بواسطة قياس التدفق الخلوي. يوضح هذا المخطط إثراء الخلايا التغصنية باستخدام حبيبات CD 11 C المغناطيسية، وفاصِل minimax، وعمودين من نوع MS. حسناً، لقد عرضت لكم للتو كيفية تحضير معلقات الخلايا المفردة من أنسجة رئة الفأر بطريقة معيارية باستخدام أنابيب C والتفكيك عن طريق الخلط اللطيف.

تسمح هذه الطريقة بتفكيك أنسجة الرئة بشكل فعال ولطيف. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تشريح الرئة بدقة ومعالجة الأنسجة فوراً بعد التشريح. ويمكن بعد ذلك استخدام معلقات الخلايا المفردة المُحضرة في تجارب لاحقة.

على سبيل المثال، الوسم المغناطيسي للخلايا، ومن ثم فصل الكريات البيضاء أو الخلايا البطانية. حسناً، هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم وبالتوفيق في تجاربكم.