تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

تبدأ هذه الإجراءات بـ CDNA تم تخليقه من قالب RNA عالي الجودة. أولاً، يتم وسم CDNA بالصبغة الفلورية SI three. وعند اكتمال تفاعل الوسم، يتم تنقية الـ CDNA الموّسم وعزله، ثم تقييم جودة تفاعل الوسم.

يتم بعد ذلك تهجين الـ CDNA المسمى على مصفوفة مجهرية. وبعد عملية التهجين، تُحلل المصفوفات لتحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات. مرحباً، اسمي سام بيترسون من مختبر الدكتورة جينيفر فريمان في كلية العلوم الصحية بجامعة بوردو.

لقد أظهرنا لكم مسبقاً كيفية استخلاص الـ RNA من أجنة أسماك الزيبرا وتحويل هذا الـ RNA إلى cDNA. وسنوضح لكم اليوم إجراء وسم ذلك الـ cDNA وتهجينه على منصة مصفوفات ميكروية من قليلات النيوكليوتيد خاصة بأسماك الزيبرا لدراسة ملفات التعبير الجيني الشاملة. وعادةً ما نستخدم هذا الإجراء لدراسة التعبير الجيني التفاضلي استجابةً للتعرض لمادة سامة.

لنبدأ الآن. تتطلب تجربة المصفوفة الدقيقة بيئة ذات إضاءة خافدة لمنع التحلل الضوئي للصبغة الفلورية Cy3 المستخدمة في الوسم. لبدء وسم cDNA باستخدام Cy3، قم بإذابة المكونات التالية من نظام BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: محلول random primer buffer بتركيز 2.5x، ومزيج dCTP بتركيز 10X، وماء خالٍ من النيوكلييز. بالإضافة إلى ذلك، قم بإذابة المخزون بتركيز 1 mM من dCTP الموسوم بـ Cy3. بعد الإذابة، قم بطرد مركزي قصير للكواشف، ثم اجمعها في أنبوب ذي جدار سميك سعة 0.6 mL.

أضف 500 nanograms من CDNA و40 µL من 2.5 x random primer buffer وماء خالٍ من النوكلياز للوصول إلى حجم إجمالي قدره 86 µL. اخلط المزيج جيداً وقم بطرده مركزياً لفترة وجيزة، ثم حضن التفاعل عند درجة حرارة 100 °C في جهاز التدوير الحراري لمدة خمس دقائق. وفي نهاية فترة التحضين، انقل التفاعل فوراً إلى حمام ثلجي لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، أخرج إنزيم exo DNA polymerase من المجمد وضعه على الثلج. ثم أضف إلى أنبوب التفاعل 10 µL من 10 X-D-C-T-P Mix و 2 µL من 1 mM SI 3D CTP و 2 µL من XO cleanout DNA polymerase، ثم اخلط جيداً وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، حضّن التفاعل عند 37 °C لمدة 16 ساعة في جهاز thermocycler حتى تنتهي عملية الوسم.

باشر بتنقية وترسيب الـ cDNA المسمى. لبدء تنقية الـ cDNA المسمى، ضع عمود MicroCon في أنبوب سعة 1.5 milliliter.

أضف 300 µL من 0.1 X SSC إلى العمود، ثم أضف تفاعل الوسم. قم بطرد العمود مركزياً عند 16,100 ×g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. لاحظ أن السائل المار قد يظهر بلون وردي فاتح.

تخلص من السائل المتدفق وأضف 300 microliters أخرى من 0.1 XSSE إلى العمود. ثم كرر عملية الطرد المركزي عند 16,100 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. مرة أخرى، تخلص من السائل المتدفق وأضف 300 microliters إضافية من T 0.1 XSSC إلى العمود، ثم قم بالطرد المركزي عند 16,100 G لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius بعد عملية الغسل الأخيرة هذه.

يجب أن يكون السائل المار صافياً، وأن يكون الـ CDNA المسمى باللون الوردي مرئياً على العمود. مرة أخرى، تخلص من السائل المار من عملية الغسل النهائية هذه لاستخلاص الـ CD NA المسمى. أضف 100 microliters من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود. أخرج العمود من أنبوبة جهاز الطرد المركزي الدقيق واقلبه في أنبوبة جديدة.

بعد ذلك، يتم وضع العمود مقلوباً في جهاز الطرد المركزي عند 2,300 G لمدة دقيقتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. يذوب الـ CDNA المُسمى في الماء الموجود في قاع الأنبوب. يتم فحص الـ CDNA المشار إليه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND 1000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

احسب تركيز DNA وقيم دمج الصبغة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. إذا كان cDNA مُوسوماً بشكل كافٍ، ضع ستة ميكروغرام في أنبوب جديد لترسيب خليط cDNA الموسوم بإضافة 0.1 ضعف الحجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 مولار عند pH 5.2، وواحد ضعف الحجم من Isopropanol مع التحضين في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

مع مراعاة تنفيذ جميع الخطوات حتى هذه المرحلة في بيئة ذات إضاءة خافضة. بعد ذلك، يتم طرد العينة مركزياً عند 16,100 G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من السائل الطافي بعناية دون تعكير راسب DNA، والذي يكون لونه وردياً.

أخيراً، يتم الغسل بإضافة 500 µL من الإيثانول بتركيز 70%، ويُخلط عن طريق القلب اللطيف، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي عند 16,100 G لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، يتم إزالة السائل الطافي، وقلب الأنبوب، وترك الراسب ليجف لمدة خمس دقائق. وبذلك يصبح الـ CDNA الموسوم جاهزاً للتهجين.

قبل البدء في عملية التهجين، قم بتشغيل نظام التهجين nimble gen واتركه حتى يصل إلى حالة التوازن عند 42 درجة Celsius. ابدأ بإذابة قرص CD NA المسمى في خمسة µL من الماء الخالي من النوكلياز لإذابة القرص. أضف مكونات التهجين من مجموعة Roche Nimble Gen Hybridization، وهي منظم التهجين Hybridization buffer hybrid A والـ alignment oligo، حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 18 µL كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق.

امزج جيداً وقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتجميع المحتويات في القاع. بعد ذلك، قم بمسخ الـ CDNA المسمى عن طريق وضع الأنبوب عند 95 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. انقل الأنبوب فوراً إلى نظام التهجين nimble gen حتى تصبح المصفوفات جاهزة.

يرجى ملاحظة أن المصفوفات الدقيقة تتطلب مناولة وتخزيناً دقيقين. تُخزن مصفوفات Roche nimble gen في الظلام مع وجود مجفف في درجة حرارة الغرفة. ضع المصفوفة في أداة محاذاة الخلاط الدقيقة.

قم بتحميل خليط X one في جهاز PMA T، ثم أزل الشريط اللاصق باستخدام الملاقط. بعد تحميل المصفوفة والخليط، أغلق جهاز PMA T بإحكام. بعد ذلك، قم بفصل المصفوفة والخليط عن جهاز PMA T عن طريق الضغط على الخليط من خلال الفتحة الموجودة في جهاز PMA T.

أخيراً، استخدم أسطوانة الضغط (brayer) لتطبيق ضغط حول الطرف الخارجي للمزج للتأكد من إحكام إغلاق المصفوفة وإزالة أي فقاعات. بعد ذلك، ضع مجمع مزج المصفوفة على نظام التهجين للتدفئة، وذلك لتحميل عينة CDNA على المصفوفة. استخدم مكبس الإزاحة ببطء وبضغط ثابت.

أضف 15 µL من العينة الموصومة في فتحة التعبئة الموجودة في مركز الخلاط. امسح أي كمية زائدة من العينة عن فتحات المنفذ وأغلقها باستخدام شرائط لاصقة. ثم أغلق المزلاج.

ابدأ الآن في خلط محلول التهجين باستخدام البرنامج B في نظام التهجين nimble gen. اترك المصفوفة الدقيقة لتتهجن لمدة تتراوح بين 16 إلى 20 ساعة. بعد التهجين، سيتم غسل المصفوفة الدقيقة ومسحها ضوئياً عندما يقترب التهجين من الاكتمال. استعد لعملية المسح الضوئي عن طريق تشغيل ماسح المصفوفات gene picks 4, 000 B واتركه ليسخن لمدة 15 دقيقة تقريباً.

بعد ذلك، قم بتحضير محاليل الغسل buffer 1 A، وbuffer B 2، وbuffer 3 كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. قم بتسخين محلول الغسل buffer 1 A إلى 42 °C، واترك المحاليل الأخرى في درجة حرارة الغرفة. عندما يسخن محلول الغسل buffer 1 A، صبّه في طبق.

اغمر حامل الشرائح في محلول الغسيل الأول B. الآن، قم بإزالة مجمع خلاط المصفوفة من نظام التهجين nimble gen وأدخله في القالب. ابدأ عملية الغسيل عن طريق غمر المجموعة في محلول الغسيل الأول A المسخن مسبقاً، ثم قم بإزالة الخلاط بعناية عن طريق تقشيره بعيداً عن الشريحة. بعد ذلك، قم بإزالة المصفوفة من القالب ورجها لمدة 15 ثانية في محلول الغسيل الأول A. انقل المصفوفة بسرعة إلى حامل شرائح مغمور في محلول الغسيل الأول B ورج حامل الشرائح بقوة لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، انقل حامل الشرائح إلى محلول الغسيل الثاني وقم برجّه لمدة دقيقة واحدة. وأخيراً، انقل حامل الشرائح إلى محلول الغسيل الثالث وقم برجّه لمدة 15 ثانية. وأتمم عمليات الغسل بنقل المصفوفة إلى جهاز طرد مركزي لتجفيف الشرائح، ثم قم بتدويره لمدة دقيقتين بعد عملية الطرد المركزي.

قم بمسح المصفوفة فوراً نظراً لحساسية D للضوء والأوزون، وابدأ عملية المسح عن طريق تحميل المصفوفة بحيث يكون الرمز الشريطي (barcode) متجهاً للأسفل في ماسح المصفوفات gene picks 4, 000 B. في مربع حوار إعدادات الأجهزة، اضبط قيمة PMT لليزر 532 nanometer على 500، واضبط الطاقة على 100% وحجم البكسل على خمس microns، وعدد الخطوط المراد حساب متوسطها على واحد، وموضع التركيز على naught microns. عند اكتمال عملية الإعداد، قم بمعاينة المصفوفة.

اختر منطقة لمسحها ثم قم بعملية المسح. وبمجرد اكتمال المسح، تحقق من المدرج التكراري للصورة (histogram). ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون قيمة 1 E-5 من العدّات المُطبعة عند حد التشبع 65,000، مما يعني أن ما يقرب من 1 إلى 2% من السمات مشبعة.

إذا كانت العدات المقيسة أقل من 1E-5، قم بزيادة كسب أنبوبة مضاعف التصوير الكهرومغناطيسي (PMT) وأعد مسح الشريحة. أما إذا كانت العدات المقيسة أكبر من 1E-5، فقم بتقليل كسب أنبوبة مضاعف التصوير الكهرومغناطيسي (PMT) وأعد مسح الشريحة، ثم احفظ الصورة واستخدم برنامجاً لتحليل البيانات من أجل تسوية البيانات وحساب قيم الكثافة. وعادةً ما ينتج عن تفاعل الوسم ما لا يقل عن 10 µg من الـ CDNA الموّسم.

يمكن حساب دمج الصبغة باستخدام نسبة صبغة أساسية بسيطة حيث تعادل نسبة النيوكليوتيد إلى SI three نسبة A two 60 إلى a five 50 مضروبة في 23.15. سيؤدي التفاعل الجيد إلى قيمة تتراوح بين 50 و 80. أما التهجين المقبول فسيكون لديه 1 إلى 2% من الميزات المشبعة.

عدد محسوب معياري بقيمة 1 E-5 عند حد التشبع البالغ 65,000. بعد ضبط قيمة PMT، وبالقرب من 500، يمكن أيضاً تقييم جودة التهجين نوعياً من خلال عرض الصورة الممسوحة ضوئياً للمصفوفة الدقيقة وتقييم كثافة القليل من النيوكليوتيدات (oligos) المصطفة مقارنة بالميزات الأخرى في المصفوفة. كما يجب فحص الصورة الممسوحة ضوئياً للكشف عن أي بقع غريبة أو شوائب غبار ضمن منطقة المصفوفة.

في التحليل اللاحق، يمكن استخدام مخطط مبعثر لتصوير البيانات التي تم تحليلها من أجل تحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات وتحديد الجينات ذات التعبير المتمايز. حيث ستنحرف الجينات ذات التعبير المتمايز بشكل ملحوظ عن خط الملاءمة الأفضل. وفي إجراء تكميلي، سبق أن أوضحنا كيفية استخلاص RNA من أجنة zebrafish وتحويله إلى cDNA مُصنّع. وقد قدمنا هنا كيفية وسم cDNA وتهجينه على منصة مصفوفة oligonucleotide لدراسة ملفات التعبير الجيني الشاملة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر دائمًا استخدام CD NA عالي الجودة وتجنب تعريض صبغة site three للإضاءة المباشرة. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.