فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

مرحباً، أنا إريكا كجي من مختبر شانون فيشر في قسم بيولوجيا الخلية والتطور بجامعة بنسلفانيا. وأنا كريس ويبر، أيضاً من مختبر فيشر. وأنا شانون فيشر.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل وظيفة عناصر المعزز (enhancer elements) باستخدام تقنية نقل الجينات في أسماك الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراسة التنظيم النسخي للجينات المهمة في التطور الهيكلي. لذا، لنبدأ.

لتحديد التسلسلات غير المشفرة المحيطة بالجينات المرشحة، نستخدم خوارزمية fast cons، والتي يمكن الوصول إليها كمسار (track) في متصفح جينوم uc SC. نحن مهتمون بشكل أساسي بالجينات التي يتم التعبير عنها أثناء التطور الهيكلي، ولكن يمكن استخدام النهج ذاته لدراسة أي جينات يتم التعبير عنها في مرحلة التطور المبكر. في المثال الموضح هنا، قمنا بتحديد التسلسلات المحفوظة.

في الفاصل الزمني المحيط بجين bumper البشري، نفحص الفاصل بالكامل وصولاً إلى الجينات المجاورة، ونحدد قيمة قطع منخفضة لدرجة السجل (log score) محددة الحجم تتوافق مع أعلى 5% تقريباً من التسلسلات غير المشفرة. بعد اختيار التسلسلات، يتم تصميم البادئات باستخدام برنامج primer three لتضخيم كل تسلسل من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الجينومي البشري، ويجب اختيار البادئات لتضخيم المنطقة المحفوظة بالإضافة إلى 30 زوجاً قاعدياً أو أكثر على كلا الجانبين. يتم تضخيم المنطقة المستهدفة باستخدام بوليميراز عالي الجودة مع DNA جينومي بشري، ثم تُستخدم إجراءات البيولوجيا الجزيئية المخبرية القياسية لاستنساخ المنتج المضخم في ناقل تعبير.

الناقل المستخدم في هذا البروتوكول هو PG wc FOS GFPA gateway. ناقل الوجهة. بعد إنشاء الناقل، تم التوجيه بنقله.

يتم أولاً نسخ الإنزيم اللازم لعملية الانتقال في المختبر باستخدام مجموعة M message M machine من شركة Ambion وبلازميد PGB 600 قبل عمليات الحقن التجريبية. ويتم اختبار فعالية كل دفعة من ناقلات الانتقال عن طريق الحقن مع مُعزز معروف مثل mouse socks. 10 enhancer.

للتحضير لعمليات الحقن، يتم سحب الإبر المستخدمة في الحقن المجهري من أنابيب شعرية زجاجية بقطر خارجي 1.2 millimeter باستخدام جهاز سحب الماصات المجهرية Sutter P 97. استخدم برنامجاً ينتج طرفاً قوياً ذا استدقاق حاد لاختراق الغشاء الكوريوني السليم باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وشريحة ميكرومتر. يتم كسر الأطراف يدوياً تحت مجهر ستيريو حتى يصل القطر الخارجي إلى 15 micrometers تقريباً.

يمكن تخزين الإبر لمدة يوم واحد في طبق حفظ مغطى. يتم الحفاظ على مجموعة أسماك الزيبرا في دورة ضوء وظلام منتظمة بواقع 14 ساعة من الضوء تحت الظروف القياسية في اليوم السابق لإجراء عمليات الحقن المجهري. يتم تحضير الأسماك لعمليات التزاوج الموقوتة في أحواض تربية صغيرة.

ضع ثلاث إناث أو ذكرين في كل حوض في صفوف متوازية في صباح يوم الحقن المجهري بعد بدء الدورة الضوئية بفترة وجيزة. ادمج الذكور والإناث في مياه نظام نظيفة ومعالجة لإنتاج البيض. افحص الأسماك بشكل متكرر واجمع البيض خلال دقائق قليلة من الإنتاج للحصول على دفعات متزامنة جيداً.

حافظ على عملية إنتاج البيض لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات عن طريق الاستمرار في تجميع مجموعات جديدة من الأسماك طوال الصباح باستخدام ماصة زجاجية واسعة الفتحة بمقاس 5.25 بوصة ومزودة بمضخة لاتكس. صنف الأجنة المجمعة في أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مليمتر، ممتلئة جزئيًا بوسط نمو الأجنة، في مجموعات مكونة من 50 جنينًا. دون وقت التجميع على غطاء كل طبق.

لكل مجموعة من الأجنة التي يتم جمعها، احتفظ بطبق يحتوي على 50 جنينًا كعينة ضابطة غير محقونة بين عمليات جمع البيض. قم بتحضير محاليل حقن طازجة عن طريق خلط المكونات التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) واحفظها على الثلج. ضع إبر الحقن في أطباق تثبيت واملأها من 1.5 إلى 2 µL من محلول الحقن.

عن طريق سحب 500 nanoliter من القطرات ووضعها على الطرف العريض لكل إبرة. سيتم سحب السائل إلى الطرف المدبب من خلال الخاصية الشعرية. قم بتجهيز إبرتين على الأقل لكل محلول حقن.

قم بتحميل الإبرة المملوءة في حامل الإبر اليدوي الخاص بمضخة بيكو نيوماتيكية (pneumatic pico pump) أو أي حاقن ضغط مماثل، على أن تكون المضخة مهيأة ومتصلة بخزان نيتروجين وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بمعايرة أحجام الحقن عن طريق قياس قطر القطيرات التي يتم طردها في زيت معدني على شريحة ميكرومترية، وعادةً ما يكون وقت الحقن 120 milliseconds.

بضغط قدره 20 PS، سأقوم باستخراج قطيرة بحجم نانولتر واحد تقريباً باستخدام مجهر ستيريو بتكبير من 6 إلى 10 أضعاف. ثبت الجنين في مكانه باستخدام ملقط دقيق، وادفع إبرة الحقن بضغط ثابت عبر الكوريون وصولاً إلى مح yolk الجنين في مرحلة الخلية الواحدة أو مرحلة الخليتين المبكرة؛ ضع طرف الإبرة في الـ yolk أسفل الخلايا الأرومية (blastomeres) مباشرة، ثم أفرغ ما يقرب من 1 لتر من محلول الحقن واسحب الإبرة. بالنسبة لكل بنية (construct)، نقوم بحقن 200 جنين أو أكثر. بعد اكتمال عملية الحقن، يتم فرز الأجنة عن طريق إزالة البويضات غير المخصبة، والأجنة التالفة، وحالات الحقن الفاشلة، أو الأجنة التي لا تحتوي على الفينول الأحمر في الخلايا الأرومية.

نقوم بعد ذلك بحضن الأجنة ووسط الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C حتى يحين الوقت المناسب لإجراء الملاحظات. وسنعرض لكم الآن بعض النتائج النموذجية لعناصر المعزز التي تنتج أنماطاً من تعبير GFP خاصة بأنسجة معينة في جنين سمكة الزيبرا. نحن ندرس الجينات التي يتم التعبير عنها في العظام أو الغضاريف خلال.

إليك مثال على عنصر مُعزز يقع في الجزء العلوي (upstream) من جين acan، والذي ينظم التعبير الجيني في غضروف الوجه والجمجمة بعد ثلاثة أيام من الإخصاب. وهنا يوجد مُعزز آخر، هذه المرة من جين bumper، والذي ينظم التعبير الجيني في الخلايا العظمية. وفي اليوم الخامس، ومن بين العديد من المُعززات التي حددناها، نجد ارتباطًا ضئيلًا بين الموقع بالنسبة للجين وتنظيم التعبير الجيني.

عند اختيار التسلسلات المراد اختبارها، من المهم تذكر أن المعزز يمكن أن يوجد على بعد مئات الكيلوبازات upstream أو downstream من الجين، أو في أحد الإنترونات كما هو ظاهر في هذا الجنين. لا يبدو أن جزءاً كبيراً من التسلسلات ينظم التعبير الجيني الخاص بالأنسجة؛ وغالباً ما تظهر هذه التسلسلات فلورة ضئيلة جداً، أو قد تظهر بعض الخلايا المتناثرة في موقعين شائعين للتعبير الجيني منتبذ، وهما البشرة والعضلات الهيكلية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحديد عناصر المعزز المحتملة من خلال الحفظ التسلسلي واختبار وظيفتها عبر التحول الجيني الموزاييكي (Mosaic transgenesis) في أسماك الزيبرا. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم فحص جودة الـ DNA والـ RNA المستخدمين في الحقن. كما يجب التأكد من فحص جميع الأجنة المحقونة بعناية، خاصة إذا كنتم تتوقعون ظهور التعبير الجيني في مجموعة صغيرة من الخلايا فقط.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.