الفيروسة البطيئة الإنتاج

تبدأ هذه العملية بنقل العدوى إلى خلايا 2 9 3 T باستخدام الفيروسات البطيئة، والبلازميد، وناقلات التعبئة الفيروسية، حيث يتم جمع السائل الطافي للفيروس بعد فترة حضانة لا تقل عن 48 ساعة. يتم ترشيح السائل الطافي لتركيزه باستخدام جهاز طرد مركزي فائق السرعة بعد عملية الطرد المركزي الفائق. يتم إعادة تعليق الراسب الفيروسي باستخدام PBS للحصول على عيار الفيروس، أولاً يتم تخفيف الفيروس المركز في أوساط نمو كاملة، ثم يتم إجراء تخفيف تسلسلي لإصابة الخلايا بالفيروسات البطيئة.

مرحباً، أنا شين وونغ من مختبر مايكل مكمانوس في مركز السكري بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. أنا مايكل مكمانوس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentiviruses).

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentiviruses) من أجل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference). لذا، لنبدأ الآن. للبدء في هذا البروتوكول، قم بتحضير الحمض النووي (DNA) الذي سيتم استخدامه في ترنسفكشن (transfect) خلايا 2 9 3 T.

أولاً، قم بتخفيف كاشف تعداء FU gene six في أنبوب سعة 1.5 مل عن طريق خلط 30 µL من Fuji six مع 600 µL من وسط خالٍ من المصل. احرص على عدم ملامسة Fuji لجدار الأنبوب أثناء إضافته إلى الوسط، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، في غطاء الأنبوب، اخلط 4 µg من البلازميد اللينتي فيروسي مع 1.33 µg.

كل ناقل تغليف فيروسي من الجيل الثالث. يحتوي البلازميد اللينتيفيروسي على DNA. سيقوم الفيروس بالإدماج في جينوم كل خلية يصيبها، بينما تحتوي نواقل التغليف على الجينات الخاصة بجميع البروتينات الأخرى المطلوبة لإنتاج فيروس لينتيفيروسي؛ أغلق الغطاء واخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

يُحضن الحمض النووي DNA وكاشف عفن الخلايا (transfection reagent) لمدة تتراوح بين 15 و20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن، حان وقت عفن خلايا 293 باستخدام الحمض النووي DNA الذي قمت بتحضيره؛ استخدم الخلايا التي تم زراعتها قبل 24 ساعة والتي وصلت درجة تلاقيها (confluency) إلى 50% إلى 70% داخل غطاء زراعة الأنسجة. قم بنقل كل كمية الحمض النووي DNA المحضرة بواسطة الماصة إلى طبق خلايا 293، وامزجها بلطف عن طريق إمالة الطبق ذهاباً وإياباً، ثم أعد الخلايا إلى المحضنة واترك عملية إنتاج الفيروسات تستمر لمدة تتراوح بين 48 و96 ساعة قبل الحصاد. خلال فترة الحضن، تنتج خلايا 293 فيروسات لينتيفيروس (lentiviruses) تحتوي جينوماتها على نسخة RNA من الحمض النووي DNA المستهدف.

حان الآن وقت جمع الفيروس. أخرج الخلايا من الحاضنة. قم بتجهيز مرشح حقنة بمسامية 0.4 أو 5 ميكرون، وحقنة بلاستيكية سعة 10 مل، وأنبوب طرد مركزي من نوع UltraClear Beckman داخل غطاء زراعة الأنسجة.

استخدم محقنة مخصصة للاستخدام مرة واحدة لإزالة الطافي، الذي يحتوي الآن على الفيروس. قم بتركيب مرشح محقنة بمسامية 0.45 ميكرون في طرف المحقنة وقم بترشيح الفيروس في أنبوب طرد مركزي من نوع UltraClear Beckman. يسمح المرشح بمرور الفيروسات فقط دون الخلايا، وبعد التخلص من المرشح، قم بتحضين جميع الخلايا المنتجة للفيروس.

نقع أطباق المزارع والمحاقن والمرشحات في محلول مبيض بتركيز 10% لمدة 45 دقيقة. الآن، وبعد جمع الفيروس وترشيحه، حان الوقت لتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق أولاً. استخدم وسط DMEM الخالي من المصل لموازنة جميع الأنابيب التي تحتوي على الفيروس بحيث لا يتجاوز الفرق بينها 0.2 جرام.

بعد ذلك، ضع أنابيب الطرد المركزي المتوازنة في سلال الدوار SW 41 TI أو SW 28. أغلق سلال الدوار بإحكام وثبتها في الدوار. ثم ضع الدوار داخل جهاز الطرد المركزي الفائق.

قم بطرد الفيروس مركزياً لمدة 90 دقيقة تقريباً عند درجة حرارة أربع درجات مئوية وبسرعة 25,000 RPM باستخدام دوّار SW 41 TI، أو بسرعة 24,000 RPM باستخدام دوّار SW 28. بعد عملية الطرد المركزي، عد إلى غطاء زراعة الأنسجة واقلب الأنبوب لصب الـ SNAT في حاوية تحتوي على bleach بنسبة 10%. استخدم منديل Kim wipe لامتصاص السوائل الزائدة حول الراسب، ثم اقلب الأنبوب في حامل مناسب لمدة لا تزيد عن خمس دقائق حتى تكون مستعداً لإعادة تعليق الراسب.

لإعادة تعليق الراسب الفيروسي، استخدم طرف مصفاة لإضافة 100 µL من محلول PBS المعقم والمصفى مسبقاً إلى الأنبوب. ثم قم بعملية السحب والدفع بالممصّة حوالي 20 مرة. اترك الفيروس عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل لإتمام عملية إعادة التعليق.

يمكنك تخزين التحضيرات الفيروسية عند درجة حرارة 4 °C لمدة أسبوع تقريبًا، وعند درجة حرارة -80 °C لمدة تصل إلى عام واحد. تذكر معالجة جميع الأنابيب الفارغة بمحلول مبيض بتركيز 10% قبل التخلص منها. إذا كنت تنوي استخدام التحضير الفيروسي لمدة تزيد عن أسبوع واحد، فيمكن حفظه في الثلاجة.

قم بإعداد حصص صغيرة تتراوح من 5 إلى 20 µL للتجارب المستقبلية، وحصة واحدة تتراوح من 3 إلى 5 µL لعملية معايرة التجميد، ثم قم بتخزين هذه الحصص عند درجة حرارة -80 °C تقريباً. الخطوة التالية هي تحديد عيار الفيروس. إذا كنت قد أدخلت جيناً مراسلاً فلورياً في بلازميد الفيروس البطيء، فسوف تظهر الخلايا المصابة وميضاً فلورياً، ويمكنك حينئذٍ تحديد عيار الفيروس باستخدام قياس التدفق الخلوي.

للبدء، يتم تخفيف 3 µL من الفيروس المركز في 1.5 mL من الوسط الكامل في الآبار من واحد إلى ستة، وذلك في صف واحد من طبق يحتوي على 96 بئرًا. يتم إجراء التخفيفات التسلسلية التالية في جميع الآبار الستة باستخدام 100 µL من وسط DM الكامل. يُضاف إلى البئر الأول 100 µL من الوسط الخالي من الفيروس.

هذه هي عينة الضبط غير المصبوغة. وفي البئر الثانية، سنضيف 100 µL من الفيروس المخفف إلى البئر الثالثة. ثم سنضيف 100 µL من الخليط الموجود في البئر الثانية إلى البئر الرابعة.

سنضيف 100 µL من البئر الثالث إلى البئر الخامس. ثم سنضيف 100 µL من البئر الرابع إلى البئر السادس. وسنضيف 100 µL من البئر الخامس.

وأخيراً، اسحب 100 µL من البئر السادسة وتخلص منها باستخدام المبيض، ثم اجعل الحجم الإجمالي في جميع الآبار 200 µL باستخدام DMEM. مع كل تخفيف، ينخفض التركيز الفيروسي إلى النصف. لاحظ أن هذه التخفيفات هي مجرد مقترحات، والتي من المفترض أن تعمل بشكل جيد لتقدير عيار معظم الفيروسات المركزة.

إذا كان عيار الفيروس منخفضاً أو غير مركز، فقد تحتاج إلى تعديل التخفيفات. عالج أي فيروس مخفف غير مستخدم بمحلول مبيض بنسبة 10% لمدة 45 دقيقة قبل التخلص منه في حاوية نفايات المخاطر البيولوجية. أضف حوالي 15,000 من خلايا 2 9 3 T السليمة والمنقسمة بنشاط إلى كل بئر من الآبار الستة.

يمكنك استخدام طبق واحد بـ 96 بئراً لتقدير عيار 16 مستحضراً فيروسياً، مع ملء الآبار حتى 200 microliters، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة وترك العدوى تتقدم لمدة 48 ساعة على الأقل. بعد الحضن، قم بتحليل فلورة الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. يمكنك استخدام النسبة المئوية للخلايا الفلورية في كل بئر لتحديد العيار أو عدد الجسيمات الفيروسية المعدية لكل milliliter من الفيروس المضاف.

احسب عدد الوحدات المعدية لكل ملليليتر باستخدام الصيغة التالية عند تفسير نتائج قياس التدفق الخلوي (Flow Cytometer). لاحظ أنه لا يمكن تحقيق حسابات دقيقة للعيار إلا عندما لا تتلقى الخلايا المصابة أكثر من دمج فيروسي واحد لكل خلية.

ولضمان تحقيق ذلك، استخدم الخلايا التي تقل نسبة العدوى فيها عن 15% لإجراء الحسابات. فمن المرجح أن الخلايا ذات معدلات العدوى الأعلى قد استقبلت جزيئات فيروسية مدمجة متعددة في الخلية الواحدة. وينبغي أن يؤدي التخفيف المقترح في الخطوة الثانية إلى الحصول على عدة عينات ضمن هذا النطاق من العدوى.

يُفضل استخدام عينات متعددة لإنشاء مخطط معايرة يمكن من خلاله حساب العيار النهائي. يمكن استخدام الصيغة المحسوبة من الخط المستقيم الموائم لحساب العيار الفيروسي، ولكن يمكنك حساب العيار باستخدام عينة واحدة إذا لزم الأمر. ومن المتوقع أن يكون العيار 1 × 10⁷ وحدة نقل لكل ملليلتر للفيروس غير المركز، و1 × 10⁸ وحدة نقل لكل ملليلتر للفيروس المركز.

لقد استعرضنا للتو كيفية إنتاج الفيروسات البطيئة عند القيام بهذا الإجراء. ومن المهم الالتزام بجميع لوائح السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات بشكل صحيح. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.