التعبئة والتغليف بفيروس نقص المناعة البشرية أو FIV المستندة إلى محددات التعبير Lentivector وتنبيغ من الجزيئات VSV-G الفيروسية Pseudotyped

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعرف على تعبئة الفيروسات البطيئة. بروتوكول يمتد لخمسة أيام. في اليوم الأول، يتم زرع خلايا 2 9 3, TN المنتجة بكثافة محسوبة.

في اليوم الثاني، يتم ترانسفكشن الخلايا ببنية ناقل lenti المختارة التي تحتوي على الجين المراد دراسته ومزيج بلازميد التغليف الفيروسي. وفي اليوم الرابع، يتم حصاد المادة الفيروسية وتركيزها عن طريق إضافة محلول ترسيب الفيروس PEG. وتتمثل الخطوات النهائية من الإجراء في حصاد الفيروس المركز بـ PEG، وتقسيمه إلى حصص (aliquots)، وإصابة الخلايا بالفيروس المركز من أجل تقدير العيار الفيروسي (viral tittering).

في النهاية، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) للجينات المدمجة بشكل مستقر لحساب عدد البنى المدمجة المستقرة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل ترانسفكشن البلازميد أو نقل الفيروسات القهقرية، في أن بروتوكول تعبئة الفيروسات البطيئة (lentivirus) المُحسّن الخاص بـ FBI ينتج فيروساً نشطاً وظيفياً وبتركيز عالٍ، مما يتيح توصيلاً فعالاً إلى أي خلية ثديية تقريباً، بما في ذلك الخلايا التي يصعب إجراء الترانسفكشن لها مثل الخلايا الجذعية والخلايا الأولية غير المنقسمة. وعموماً، يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبات بسبب عدم إلمامهم بالتفاصيل الصغيرة للبروتوكول، والتي تعد أساسية للإنتاج الناجح للفيروسات ذات التركيز العالي.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً لأن كثافة الخلايا التي يتم فحصها عبر المجهر أثناء عملية عفن الخلايا (transfection) تحدد كفاءة التعبئة الفيروسية، والتي بدورها تحدد العيار الفيروسي النهائي. وفي الحالات التي يتوفر فيها مراسل فلوري، فإن تعبير هذا المراسل يحدد كفاءة عفن الخلايا، وهو ما يؤثر بشكل كبير على العيار الفيروسي النهائي. بالإضافة إلى ذلك، يساعد العرض المرئي لهذه الطريقة الباحثين على التعرف على أجزاء دقيقة ولكنها مهمة في البروتوكول، مثل أفضل الممارسات للحفاظ على التعقيم طوال العملية، وكيفية تجنب إدراج حطام الخلايا في الفيروس المحصود.

تعتمد عملية التغليف الفعالة للفيروسات البطيئة (lentiviral packaging) على ثلاثة مكونات. أولاً، يجب أن يحتوي ناقل التعبير الفيروسي البطيء على بعض العناصر اللازمة لتغليف الفيروس والاندماج المستقر، بالإضافة إلى العناصر اللازمة للتعبير عن الجين المستهدف، سواء كان ذلك على شكل RNA ذو دبوس شعر قصير (Short hairpin RNA)، أو micro RNA، أو كاسيت مراسل (reporter cassette).

ثانيًا، يجب أن توفر بلازميدات التعبئة الفيروسية البطيئة البروتينات الأساسية لتعبئة نسخة RNA من بنية التعبير في جسيمات فيروسية كاذبة معاد تركيبها، وما يلي ذلك من نسخ عكسي ودمج فيروسي عند العدوى. ثالثًا، يجب إجراء ترانسفكشن مشترك مؤقت لخلايا المنتج 2 9 3 TN باستخدام ناقلات التعبير والتعبئة. وتنتج هذه الخلايا عيارات عالية من الجسيمات الفيروسية الكاذبة التي يتم حصادها من أوساط الزرع.

في نهاية المطاف، يعتمد النجاح في نقل الجينات إلى الخلايا المستهدفة بشكل أساسي على عدد الجسيمات الفيروسية لكل خلية لنوع معين من الخلايا. وبعبارة أخرى، فإن تعدد العدوى (multiplicity of infection) يبدأ من خلال استنبات خلايا 2 9 3 TN في أطباق زراعة خلوية قياس 15 سنتيمتر لمدة تتراوح بين 18 إلى 24 ساعة للوصول إلى درجة تلاقي تتراوح بين 60 إلى 80%.

عند وقت ترنسفكشن، ستنتج كل لوحة ما يقرب من 14 مليون خلية لزيادة حصيلة الفيروس. يمكن استخدام أكثر من لوحة واحدة في اليوم التالي عندما تصل خلايا 2 9 3 TN إلى نسبة تلاحم تتراوح بين 60 إلى 80%، حيث تصبح جاهزة لعملية الترنسفكشن. لكل لوحة من الخلايا، أضف 1.6 milliliters من وسط DMEM الخالي من المصل إلى أنبوب فالكون سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، أضف 22.5 micrograms من ppac H one أو Ppac F1 و 4.5 micrograms من ناقل lenti vector Construct إلى وسط DMEM واخلط المزيج عن طريق السحب والضخ بالماصة. بعد ذلك، أضف 55 microliters من pure affection إلى الأنبوب نفسه وقم بالرج الدوامي لمدة 10 seconds، يليه تحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 minute. بعد مرور 15 minutes، أضف أنبوباً واحداً إلى كل طبق زرع.

أضف المحلول قطرة بقطرة ثم قم بتدوير الطبق بلطف، بعد ذلك يتم تحضين الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide. بعد مرور 48 ساعة، إذا كان تركيب ناقل lenti يعبر عن جين فلوري مثل GFP، فافحص الخلايا تحت المجهر؛ حيث سيؤدي التعداء الناجح إلى ظهور 50 إلى أكثر من 90% من الخلايا ذات الفلورة الخضراء. قم الآن بجمع الطافي من مستنبت الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. يحتوي الطافي على الجسيمات الفيروسية الكاذبة المعدية.

لن تؤثر أي خلايا تنفصل عن الطبق سلبًا على إنتاج الفيروس. ولإزالة الحطام، يتم طرد مركزي للسائل الطافي الفيروسي عند 1500 G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، وبدون تعكير الراسب، يتم جمع السائل الطافي الفيروسي مع الحرص على ترك حاجز من السائل الطافي يبلغ حوالي 500 microliters، ثم الانتقال إلى الخطوة التالية، وهي تركيز الجزيئات الفيروسية بعد 72 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection).

يمكن إجراء عملية تجميع ثانية اختيارية للطافي الفيروسي باستخدام التقنية نفسها بعد تجميع الحالة الفيروسية. يتم التركيز عن طريق إضافة حجم واحد من محلول ترسيب الفيروس peg المبرد بالثلج إلى كل أربعة أحجام من الطافي في أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter. يتم قلب المحلول لخلطه.

تجنب استخدام جهاز الرج الدوامي (vortex) تماماً، ثم قم بتخزين المحلول دون تحريك عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 96 ساعة. بعد تبريد المحلول لمدة لا تقل عن 12 ساعة، قم بطرد الخليط مركزياً عند 1500 G لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، ستظهر جسيمات الفيروس البطيء (lentiviral particles) المرسبة بواسطة peggo على شكل قرص بيج أو أبيض اللون في قاع الأنبوب.

الآن، قم بإزالة جميع آثار السائل عن طريق الشفط الدقيق دون تعكير جزيئات الفيروسات البطيئة المترسبة في الراسب. بدلاً من ذلك، قم بإزالة معظم السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في السائل الطافي المتبقي. ثم انقل المعلق إلى أنبوب إبندورف معقم سعة 2 mL وقم بطرد الأنبوب مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد لمدة دقيقتين.

عند سرعة 14,000 RPM، اسحب السائل الطافي المتبقي باستخدام الماصة، ثم أعد تعليق كتلة جزيئات الفيروس البطيء في محلول منظم معقم وبارد (في الثلج) بحجم يتراوح من 1/10 إلى 1/100 من الحجم الأصلي. انقل الكتلة بعناية بواسطة الماصة إلى المحلول دون تكوين أي فقاعات، مع الحفاظ عليها باردة في جميع الأوقات. تأكد من إعادة تعليق الكتلة بالكامل.

أخيرًا، قم بتقسيم الحبر إلى حصص تتراوح بين 15 إلى 25 µL في أنابيب تجميد مبردة معقمة على الثلج، ثم خزن الأنابيب عند درجة حرارة -70 °C. ستنتج عملية التعبئة الناجحة من 10 مليون إلى 1000 مليون IFU لكل mL لعملية نقل الفيروس في طبق زراعة مكون من 24 بئرًا، بمعدل 50,000 خلية لكل بئر، مع تنميتها طوال الليل في ظروف الزراعة المحددة لها. يجب أن تتراوح نسبة تلاقي الخلايا بين 50 إلى 70% عند إجراء عملية النقل لأغراض تحديد العيار.

يمكن استخدام خلايا HT 10 80 كخط خلوي ضابط سهل التحول؛ في اليوم التالي، يتم سحب الوسط من الخلايا. ثم اخلط وسط الزرع مع محلول ducks المركز، بحيث يكون التركيز النهائي لـ trans ducks هو 1x، وأضف 0.5 mL من المادة المحولة إلى كل بئر تحتوي على الخلايا المستهدفة بكثافة صحيحة تتراوح من 50 إلى 70% من درجة الاندماج (confluency). أضف الفيروس إلى كل بئر بالتخفيفات التالية: 1:100، و1:10، وتخفيف مباشر بنسبة 1:1.

يمكن للفيروس أن يظل على اتصال بالخلايا المستهدفة لمدة تصل إلى 72 ساعة دون تغيير الوسط. بعد 72 ساعة، سيكون الفيروس المدمج قد اندمج بشكل مستقر في جينوم المضيف وبدأ في التعبير عن الجين المطلوب. وفي حال وجود تعبير عن علامة فلورية يمكن استخدامه لتقدير كفاءة التنحيح مع تخفيفات فيروسية مختلفة، فعندئذٍ يمكن تقدير عدد الوحدات المعدية كمياً بواسطة QPCR.

بمجرد معرفة عيار الفيروس، احسب الحجم المناسب من الفيروس لتحقيق تعددية العدوى المطلوبة للخلايا المستهدفة الأخرى. يضمن قياس العيار والتحكم في MOI الاتساق بين التجارب وبين التحضيرات الفيروسية المختلفة. أصبح الفيروس الآن جاهزاً للاستخدام في تجارب إضافية.

كانت الكثافة البدائية لخلايا 2 9 3 TN حاسمة لنجاح التعبئة الفيروسية في يوم عفن الخلية (transfection). وكانت هذه الخلايا 2 9 3 TN في حالة تلاقي (confluent) تتراوح بين 60 و 80%. وبعد 24 ساعة من عفن الخلية الناجح باستخدام ناقل لنتيفيروسي (lenti vector) يعبر عن GFP، تبيّن أن 90% على الأقل من خلايا 2 9 3 TN أظهرت تألقاً أخضر.

بعد مرور 72 ساعة من عملية التنبيغ، استمر التعبير عن GFP في الخلايا المضيفة HT 10 80. يشير هذا إلى أن البنية اللينتيفيروسية قد اندمجت بشكل مستقر في جينوم المضيف؛ وبالمقابل، أدى تنبيغ نفس الخلايا المضيفة بتخفيف بمقدار عشرة أضعاف إلى انخفاض تناسبي في التعبير عن GFP، وذلك لأن العلاقة بين عيار الفيروس والتعبير الجيني بوساطة اللينتيفيروس هي علاقة طردية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها على مدار خمسة أيام بمعدل ساعة إلى ساعتين تقريباً يومياً إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعبئة الجسيمات الفيروسية المعدية وظيفياً بكفاءة وأمان، وكيفية نقل الفيروس إلى الخلايا بنجاح. لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات البطيئة (lentivirus) قد يكون خطيراً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل غطاء استنبات الأنسجة من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL two).

يجب دائمًا ارتداء معطف المختبر والقفازات عند تنفيذ هذا الإجراء.