جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة

من أجل إجراء عمليات إعادة بناء للأعضاء النامية داخل ذبابة Drosophila melanogaster، نحتاج إلى تحديد النموذج الأمامي الذي يصف بشكل أفضل انتشار الضوء داخل الخادرة نفسها. تبدأ الإجراءات باختيار خادرة بيضاء أولية ولصقها عند نهاية أنبوب شعري بحيث يكون المحور الأمامي الخلفي للخادرة موجهاً بشكل موازٍ للأنبوب. يتم ملء أنبوب شعري صغير ببعض الصبغة الفلورية وإدخاله في غلاف الخادرة.

بعد ضبط المحاور بدقة، يتم تدوير الخادرة بمقدار 360 درجة. ثم يتم التقاط الصور من زوايا مختلفة. وتُستخدم بيانات الإضاءة النافذة الفلورية المكتسبة لتحديد النموذج الأمامي الذي سيُستخدم لتصوير تطور العضو.

مرحباً، اسمي كلوديا وأعمل في مركز المساعدة البيولوجية في مستشفى ماساتشوستس العام، بكلية الطب بجامعة هارفارد. وأنا أولا بيتو من مختبر باراماونت في كلية الطب بجامعة هارفارد، وأنا دانيال روزانسكي من معهد التصوير البيولوجي والطبي في جامعة ميونخ التقنية ومركز هيليمان في ميونخ. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد للجسم كاملاً في *Oph Melano Casta*.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للتصوير الحي للأعضاء النامية خلال حالة الحدقة. لذا، دعونا نبدأ. قبل البدء، يرجى ملاحظة عدم وجود فيديو مصاحب يجب مشاهدته قبل هذا الفيديو، حيث يتم شرح بعض الجوانب التقنية للتصوير المقطعي الإسقاطي البصري بتفصيل أكبر مما هو مقدم هنا.

بالإضافة إلى ذلك، يوضح الفيديو الآخر تصوير الأنسجة أو الأعضاء المحضرة من حيوانات أكبر حجماً. وبالنسبة لجميع التجارب التي يتناولها هذا الفيديو، سيتم استخدام جينات منقولة في ذبابة الدروزيوفيلا (drosophila). وهي EL A gal four التي يتم التعبير عنها في الغدد اللعابية، وapteris gal four التي يتم التعبير عنها في الأنسجة السلفية اليرقية للجناح والصدر في الحشرة البالغة، بالإضافة إلى الجين المنقول الذي ينتج البروتين الفلوري.

استجابةً لـ gal four المسمى U-A-S-G-F-P و white 1118، يتم تزويج ذكور التحكم غير الفلورية التي تحمل جينات UAS المنقولة إلى إناث بكر تحمل جينات GAL four المنقولة لتحقيق تعبير نسيجي محدد لـ GFP. يتم إعداد تزاوجات من ثماني إلى 10 إناث بكر وذكور على وسط ذباب قياسي مع رشّة من خميرة الخباز. وتوضع القوارير على السطح عند 25 degrees Celsius في حاضنة رطبة تحت دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة.

بعد يومين من بدء عملية التهجين، يتم نقل الآباء إلى قارورة جديدة، وبعد خمسة إلى ستة أيام، سيبدأ الـ PUI في ملء القارورة بـ PrepU. يتم اختيار الـ I بناءً على تعبير GFP تحت مجهر تشريحي فلوري. يضمن اختيار pre pui الأبيض تحديد المرحلة العمرية الصحيحة للحيوانات لأنها تظل بيضاء لمدة ساعة تقريبًا.

بعد عملية التبويض، تصبح البويضات مصبغة أو مائلة للبني. يتم جمع البويضات التي تعبر عن GFP برفق من القوارير باستخدام فرشاة تلوين مبللة، وتوضع في قطرة من الماء أو PBS في أطباق بتري، مع ضرورة مسح الفرشاة جيداً من المواد ذات الفلورية الذاتية. وباستخدام فرشاة التلوين، تصبح البويضات الآن جاهزة للتصوير المقطعي.

إذا كانت PrepU بحاجة إلى الاستمرار في النمو للوصول إلى المرحلة التطورية الصحيحة، فيمكن تركها في طبق بتري مع منشفة ورقية مبللة أو في قارورة طعام نظيفة. سيضمن ذلك توفر الرطوبة الكافية والنمو السليم من أجل التصوير. يجب تثبيت PrepU في الجزء الداخلي من أنبوب شعري زجاجي بقطر 800 micron.

قم بطلاء الطرف الخلفي للعذراء بالغراء الفائق، ثم وجه السطح المغلُوّ من مرحلة ما قبل العذراء داخل الأنبوب بحيث يكون المحور الأمامي الخلفي للذبابة موازياً للأنبوب. سيبقى الجزء الأمامي من الحشرة بارزاً خارج الأنبوب الشعري. يتم الآن تثبيت الأنبوب الشعري على المنصة الدوارة للمجهر.

في وضع عمودي، اضبط محور الإمالة للمنصة الدوارة بحيث يكون المحور الدوراني للأنبوب موازياً لأعمدة البكسل في كاميرا CCD للتصوير. بعد ضبط موضع الذبابة بدقة، ابدأ بعملية التصوير. في هذا المثال، سيتم تصوير حيوانات ذات غدد لعابية فلورية؛ حيث يمكن إنتاج ذباب يعبر عن GFP في غدده اللعابية من خلال تهجين بين سلالات EAG four و U-A-S-G-F-P.

نبدأ بعينة مثبتة لمرحلة ما قبل الخادرة، حيث يتم إضاءة ما قبل الخادرة بحزمة استثارة وجمع إشارة الفلورة الخاصة بـ GFP. وفي وضع الإضاءة النافذة، يتم تدوير ما قبل الخادرة بمقدار 360 درجة على طول محورها الرأسي والتقاط صور الإضاءة النافذة. وتتوافق كل صورة مع 10 درجات من الدوران.

يعتمد وقت الاستحواذ الإجمالي على كمية الفلورة وكثافة شعاع الإثارة. وعادة ما تكون الأوقات في حدود دقيقة واحدة. في هذا المثال، سيتم تصوير خادرة DSO التي تعبر عن GFP في الأقراص التخيلية للجناح.

يمكن جمع هذه الخادرة من قارورة ناتجة عن تهجين بين سلالات Aus GAL four و U-A-S-G-F-P. يتم تثبيت ما قبل الخادرة كما تم وصفه سابقاً. ومع ذلك، وبما أن وقت التصوير في هذه التجربة يبلغ حوالي ثماني ساعات، فمن الضروري أن تظل البيئة رطبة وفي درجة حرارة الغرفة لتجنب جفاف الحيوان وموته؛ لذا يُوضع غالق فوق شعاع الإثارة لمنع خمود الفلوروفورات في النسيج المستهدف، وكذلك لضمان عدم احتراق الحيوان بشعاع الليزر. وكما سبق، يتم الإضاءة بشعاع الإثارة وجمع إشارة فلورة GFP عن طريق الإضاءة النافذة.

يتم تدوير ما قبل العذراء بالكامل على طول محورها الرأسي. وخلال عملية جمع البيانات، تستغرق عملية التدوير دقيقة واحدة فقط وتتكرر على فترات زمنية مختلفة. ولإنشاء سلسلة صور بنظام التصوير الزمني (time lapse) للأجنحة أثناء النمو، يمكن الحصول على البيانات لمدة ست ساعات على الأقل بمعدل 100 صورة في الساعة.

من الضروري التحكم في إجمالي التعرض للضوء باستخدام هذا الغالق لمنع حدوث ضرر أو تبييض ضوئي. يعرض هذا المقطع صوراً تم الحصول عليها في الفترة ما بين مرحلة PrepU وتجنب حدقة الرأس. عند إعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد، يكون هناك تشتت أمامي قوي يجب أخذه في الاعتبار، وهو أمر لا يمكن تقديره عن طريق الانتشار.

لإجراء عملية إعادة البناء، يجب تحديد نموذج تشتت أمامي لانتشار الضوء. وللتبسيط، نهمل الامتصاص. يتم اختبار مقدار التشتت تجريبياً؛ وللقيام بذلك، يتم إدخال جسم غريب ذي فلورة قياسية في مرحلة ما قبل الخادرة البيضاء 1118 غير الفلورية، والتي يتم مسحها بعد ذلك لتوليد بيانات النموذج الأمامي. ابدأ بملء أنبوب شعري من السيليكا بقطر 100 micron بصبغة PS 5.5 الفلورية.

باستخدام الخاصية الشعرية، ادفع الأنبوب الشعري داخل الخادرة بزاوية 45 درجة بالنسبة للمحور الأمامي، وثبّت عينة الـ PrepU في أنبوب شعري وضعها بشكل مناسب على المنصة الدوارة كما تم وصفه سابقاً. الآن، قم بإضاءة ما قبل الخادرة بحزمة ليزر إثارة باستخدام عدسة ذات فتحة عددية منخفضة، واجمع صور الإضاءة النافذة الفلورية لما قبل الخادرة. وكما تم وصفه سابقاً، يُستخدم برنامج MATLAB لمطابقة البيانات مع النموذج النظري الأمامي الصريح. ولتسهيل عملية إعادة البناء، يتم اختيار تقريب diffusion لمعادلة النقل لأنه يصف نظام التشتت الأمامي ويتوافق أيضاً مع البيانات التجريبية.

بعد تحديد النموذج الأمامي الصحيح، يمكننا إعادة بناء الغدد اللعابية والحصول على عمليات إعادة بناء توموغرافية بفاصل زمني. وإذا كنت تخطط لاستخدام التوموغرافيا في الفضاء الحر، فيمكن أيضاً إعداد خوارزميات التكوين لمطابقة معامل الانكسار. أولاً، نعرض إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للغدد اللعابية في مرحلة مبكرة من النمو.

وللمقارنة، يُظهر التلوين النسيجي للغدد اللعابية أن عمليات إعادة البناء تتوافق بشكل جيد مع علم الأنسجة. تم الحصول على هذا الفيلم بنظام التصوير الزمني لتطور الأقراص التخيلية للجناح من عينة حية واحدة. وللمقارنة، يُظهر التلوين النسيجي لقرص الجناح في نفس النقاط الزمنية أن عمليات إعادة البناء تتوافق بشكل جيد مع علم الأنسجة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية بناء نظام لتصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد داخل Drosophila in vivo، وبمرور الوقت. يتيح لنا ذلك تتبع عملية التخلق الشكلي (morphogenesis) في Drosophila، ومتابعة تطور الأجنحة على مدار ست ساعات متتالية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من الضروري اختيار النموذج الأمامي الصحيح لانتشار الضوء داخل drosophila.

يمكن استخدام هذه الطريقة بالاشتراك مع التقنيات النسيجية لتسليط الضوء على تطور الأعضاء خلال مراحل بؤبؤ العين في الأوبوفالوس، كما يمكن تعديلها لدراسة كائنات حية مختلفة ذات حجم مماثل. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.