تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

مرحباً، أنا هوب كامبل، أخصائية قياس التدفق الخلوي من معهد أبحاث الدم في مركز الدم في ويسكونسن. مرحباً، أنا إس تي آر باسو، طالب دراسات عليا في مختبر الدكتورة بوني ديتر، وأعمل أيضاً في معهد أبحاث الدم في مركز الدم في ويسكونسن.

سنقوم اليوم بإجراء عملية عزل الخلايا باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشط فلورياً. نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة وظائف الخلايا اللمفاوية ومجموعات الخلايا النخاعية. لنبدأ.

في هذا الإجراء، سيتم تنقية الخلايا التائية من نوع B وCD4 من الخلايا المكونة للدم في الفئران. يجب حساب العدد البدائي للخلايا المستهدفة بناءً على عدد الخلايا المطلوبة ومعدل الاسترداد الخاص بالجهاز عند استخدام هذه الطريقة. يتراوح معدل الاسترداد النموذجي للخلايا التائية من نوع B وCD4 بين 85 و90%. تبلغ نسبة مجموعة خلايا SP البدائية تقريبًا 60 إلى 70% من الخلايا B و20 إلى 30% من الخلايا التائية.

وبالتالي، إذا بدأت بـ 100 × 10⁶ خلية، ستتمكن من استعادة 50 إلى 60 مليون خلية B و20 إلى 30 مليون خلية T قبل البدء في عملية الفرز. يجب وضع المحاليل والكواشف اللازمة للبروتوكول على الثلج. وتشمل هذه المواد: محلول التلوين العازل المكون من محلول ملحي منظم بالفوسفات مع 3% fetal calf serum، ومحلول تعليق عازل يتكون من 25 millimolar HEPs مُحضّر في محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) المحتوي على 3% fetal calf serum، ومحلول 25 millimolar hep B مُحضّر في fetal calf serum، والأجسام المضادة للتلوين، وحبيبات التعويض.

يتطلب هذا البروتوكول أيضاً المستلزمات والكواشف التالية: أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter، وأنابيب تدفق من البوليسترين أو البولي بروبيلين بمقاس 12 by 75 millimeter. ومصفاة خلايا من النايلون، وصبغة trypan blue، ومقياس كرات الدم hemocytometer. كما يجب تحضير أنابيب تجميع الفرز مسبقاً للقيام بذلك.

أضف 300 µL من محلول FCS HEPES إلى أنابيب التدفق أو 1 mL من محلول FCS HEPES إلى أنابيب مخروطية سعة 15 mL. يجب وضع هذه الأنابيب على الثلج حتى تبدأ عملية الجمع. ابدأ بتجهيز معلق خلوي أحادي من المجتمع الخلوي المطلوب.

إذا كانت الخلايا المعزولة باستخدام هذا الإجراء سيتم استزراعها، فيجب تنفيذ عملية تحضير الخلايا بأكملها داخل غطاء خزانة استنبات الأنسجة. باستخدام تقنية التعقيم، اغسل الخلايا مرة واحدة بإضافة منظم تلوين مبرد بالثلج، ثم أعد تعليق الخلايا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي للخلايا لمدة تتراوح من سبع إلى ثماني دقائق عند حوالي 250 g في درجة حرارة 4 °C. قد تختلف ظروف الغسيل حسب نوع الخلايا وتركيزها. بالنسبة للخلايا اللمفاوية، يتم غسل ما يصل إلى 200 × 10⁶ خلية باستخدام 10 mL من محلول التلوين المنظم.

قم بإزالة السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط بحيث تظل كتلة الخلايا المترسبة سليمة. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في محلول منظم للتلوين مبرد على الثلج بتركيز يصل إلى 50 × 10⁶ لكل 100 µL. أعد تعليق كتلة الخلايا عن طريق هز الأنبوب أو استخدامه في جهاز الرج (vortex) بلطف.

ثم يتم نقل 0.25 إلى 1 × 10 من الخلايا الست إلى أنبوب تدفق جديد من البوليسترين أو البولي بروبيلين بمقاس 12 × 75 مليمتر على الثلج. ويُترك هذا الأنبوب جانباً لاستخدامه لاحقاً كعينة ضابطة غير مصبغة. وفي الأنبوب الأول، تُضاف الأجسام المضادة الأولية إلى معلق الخلايا للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب. هنا، تُستخدم الأجسام المضادة anti B220 المقترنة بـ PE Texas Red لصبغ الخلايا B، بينما تُستخدم الأجسام المضادة anti TCR R beta المقترنة بـ ZI و/أو الأجسام المضادة anti CD4 المقترنة بـ 700 لصبغ الخلايا T. ثم يُخلط المزيج عن طريق نقر قاع الأنبوب أو عن طريق الرج الخفيف.

قم بالرج الميكانيكي (Vortexing)، ثم ضع الخلايا على الثلج واتركها تحضن في الظلام لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. بعد فترة التحضين، اغسل الخلايا الموصومة باستخدام Resus، وذلك بتعليقها في 10 milliliters من محلول التعليق المبرد بالثلج، والمنظم، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي كما سبق، بعد إزالة السائل الطافي بعناية. كرر هذه الخطوة لغسل الخلايا مرة ثانية.

أخيرًا، أعد تعليق الخلايا في محلول تعليق (suspension Buffer) بارد جداً. إذا لم تكن الأجسام المضادة الأولية مرتبطة مباشرة بفلورو فور، أضف أجساماً مضادة ثانوية مُعلمة أو strep AVID مُقترن إلى معلق الخلايا، ومرة أخرى، قم بتحضين الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة بعد التحضين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول تعليق بارد جداً.

بعد إعادة تعليق الخلايا في محلول تعليق مبرد بالثلج، حدد تركيز الخلايا وحيويتها باستخدام صبغة حيوية مثل tripan blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer). اضبط تركيز الخلايا ليكون ما بين 10 إلى 20 × 10⁶ خلية/مل عن طريق إضافة محلول التعليق، وذلك لتجنب انسداد جهاز fax بتجمعات الخلايا التي قد تكون قد ماتت أثناء عملية العزل.

الإجراء والصبغ. يتم ترشيح الخلايا عبر مصفاة تقطير مباشرة قبل البدء في بروتوكول الفرز. يجب اختيار حجم مسام المصفاة بناءً على نوع الخلية، حيث تُستخدم للخلايا ذات النواة مصفاة بحجم مسام 40 micrometer.

اجمع الخلايا المفلترة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل أو أنابيب تدفق قياس 12 × 75 مليمتر بناءً على الحجم. وضع الخلايا على الثلج أثناء إعداد جهاز قياس التدفق الخلوي لإجراء عملية الفرز. في حال استخدام حبيبات BD comp كضوابط إيجابية أحادية اللون، قم بتحضير أنبوب ضابط واحد لكل لون مستخدم في المقايسة، بالإضافة إلى أنبوب ضابط سلبي غير مصبوغ.

بعد رج معلقات الخرزات جيداً باستخدام جهاز الـ vortex، أضف قطرة واحدة من كل من معلقات الخرزات السالبة والموجبة إلى 100 µL من منظم التعليق (suspension buffer) لكل لون مستخدم وللعينة الضابطة السالبة. بعد ذلك، أضف 1 µL من الجسم المضاد المسمى إلى كل أنبوب تحكم موجب. في هذه التجربة، يتم تحضير أنبوب واحد باستخدام الأجسام المضادة PE Texas'Red B two 20.

يتم استخدام واحدة باستخدام أجسام مضادة لـ ETCR beta وأخرى باستخدام أجسام مضادة لـ lor 700 CD four، وتُخلط عن طريق نقر أسفل الأنابيب ثم تُحضن لمدة 15 إلى 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. تُغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام 2 mL من محلول التلوين المنظم، وتُفصل بجهاز الطرد المركزي عند 200 Gs لمدة 10 دقائق. يُزال السائل الطافي عن طريق الشفط، ثم يُعاد تعليق راسب الخرزات في 200 إلى 500 µL من محلول التلوين.

يختلف إعداد المحلول المنظم لجهاز قياس التدفق الخلوي اعتماداً على الشركة المصنعة، ويجب ألا يتم القيام به إلا من قبل موظفين مدربين بشكل مناسب. سيتم تنفيذ إجراء فرز الخلايا هنا باستخدام جهاز BD FACS Aria. قبل البدء في الفرز، اختر الفوهة المناسبة بناءً على نوع الخلايا المراد فرزها.

الأحجام المتاحة لفوهات الجهاز هي 70 micrometers، و100 micrometers، و130 micrometers. يجب أن يكون حجم الفوهة ثلاثة أضعاف حجم الخلية المراد فرزها على الأقل؛ لذا يتم اختيار الفوهة بحجم 70 micrometer لفرز الخلايا اللمفاوية. ويمكن إجراء فرز الخلايا بطريقة معقمة باستخدام خيار الفرز المعقم (aseptic sort) المتوفر في الجهاز.

باستخدام هذا الخيار، يتم تطهير مسار الغمد بالكامل باستخدام ethanol بنسبة 70% وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من استبدال مرشحات الغمد واستبدال PBS بـ PBS معقم. وبمجرد أن يصبح جهاز قياس التدفق الخلوي جاهزاً للعمل، ضع أنابيب الجمع المبردة مسبقاً والتي تحتوي على heaps FCS في جهاز الجمع المناسب.

يمكن لأجهزة التجميع المتاحة استيعاب ما يصل إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 milliliter. أو أربعة أنابيب مقاس 12 by 75 millimeter أو أربعة أنابيب دقيقة (micro tubes). استخدم الأنابيب مقاس 12 by 75 millimeter لجمع أقل من 1.5 × 10⁶ خلية، والأنابيب المخروطية سعة 15 milliliter لجمع ما بين 1.5 × 10⁶ إلى 4.5 × 10⁶ خلية.

ضع جهاز الجمع المناسب في غرفة جمع الفرز. وجّه التيارات الجانبية نحو جهاز الجمع المثبت في حالات الفرز متعدد الألوان. يجب أولاً معايرة جهاز قياس التدفق الخلوي لمراعاة التداخل الطيفي بين الكواشف.

يوضح المثال المعروض هنا التداخل بين أطياف انبعاث Fit E و PE. يُطلق على هذا التداخل الموضح في المنطقة المظللة باللون الداكن اسم التدفق (spillover). وفي هذه الحالة، سيتم الكشف عن تدفق PE في قناة Fit E، بينما سيتم الكشف عن تدفق Fit E في قناة PE.

يجب تصحيح هذا التداخل (spillover) من أجل التخلص من الفلورة المتبقية لفلور واحد في قناة أخرى. وتسمى عملية تصحيح التداخل هذه التعويض (compensation)؛ ولإجراء التعويض اليدوي، استخدم برنامج قياس التدفق الخلوي (cytometry software) لإنشاء نموذج يتضمن مخططاً ثنائي المتغيرات لعرض التشتت الأمامي FSC والتشتت الجانبي SSC، ومخططاً تكرارياً (histogram) واحداً لكل فلور سيتم استخدامه.

تختلف طريقة إعداد هذه المخططات البيانية اعتماداً على البرنامج المستخدم. ضع أنبوبة التحكم السلبي في منفذ تحميل جهاز قياس التدفق الخلوي وابدأ في الحصول على البيانات أثناء تشغيل العينة. اضبط تشتت الضوء الأمامي (FSC) وتشتت الضوء الجانبي (SSC) لوضع المجموعة المستهدفة ضمن المقياس.

بعد ذلك، اضبط إعدادات أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) للفلورة بحيث تقع المجموعة السالبة أو الفلورة الذاتية في أقصى الجانب الأيسر من المخطط التكراري. قم بتسجيل أنبوبة الضابط السالب. أخرج أنبوبة الضابط السالب من منفذ تحميل مقياس التدفق الخلوي واستبدلها بأنبوبة الضابط الموجب الأولى.

ابدأ الآن عملية الاستحواذ. كرر هذه العملية لكل أنبوب من أنابيب الضبط الموجب مع تسجيل البيانات الخاصة بكل أنبوب. وبالنسبة لكل عينة ضبط موجب، ارسم بوابة فاصلة أو مربعاً حول الأحداث المسجلة في المخطط التكراري.

بعد ذلك، ارسم بوابة فاصلة أخرى في الجزء السلبي من المدرج التكراري. عند إجراء التعويض اليدوي، ضع في اعتبارك كل فلور مستخدم في التجربة من خلال ضبط الوسيط للمجموعات الإيجابية حتى يتساوى مع وسيط المجموعات السلبية. ولضبط الوسيط، قم بتعديل قيم التداخل الطيفي، سواء بالزيادة أو النقصان، حتى يتطابق الوسيط لكل معيار فلوري قدر الإمكان.

باستخدام الإعدادات التي تم تحديدها بواسطة عينات الضبط الموجبة والسالبة، استعد لإجراء عملية الفرز عن طريق تحديد إعدادات البوابة للعينة التجريبية. ضع أنبوب الخلايا المراد فرزها في منفذ تحميل جهاز قياس التدفق الخلوي وابدأ عملية الاستحواذ بسرعة تتراوح من 9 إلى 10,000 حدث في الثانية. اختر مخطط تشتت نقطي لعرض التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي.

يعد التشتت الأمامي مؤشراً عاماً لحجم الخلية ويوضع على المحور x، بينما يعد التشتت الجانبي مؤشراً على حبيبية الخلية ويوضع على المحور Y. الآن، قم بتحديد بوابة مجموعة الخلايا المستهدفة. وبمجرد تحديد البوابات، تحقق من ضبط درجة حرارة منفذ التحميل في جهاز قياس التدفق الخلوي عند 4 °C.

بعد ذلك، ضع أنبوب العينة التجريبية في فتحة التحميل. اضغط على خيار الفرز وابدأ عملية الجمع، مع مراعاة وضع أنابيب الجمع على الثلج أثناء ملئها. استمر في عملية الفرز حتى يتم جمع العدد المطلوب من الخلايا أو حتى يفرغ أنبوب العينة.

بعد ذلك، أوقف عملية الفرز عن طريق اختيار زر الفرز مرة أخرى وقم بإزالة العينة من منفذ التحميل. بعد ذلك، ضع أنبوب الجمع مباشرة على منفذ التحميل الخاص بمقياس التدفق الخلوي واجمع من 500 إلى 1000 حدث. وباستخدام نفس الإعدادات المستخدمة في فرز الخلايا التائية T cells، أدت إجراءات الفرز إلى زيادة النقاء من 21 إلى 99%. أما بالنسبة للخلايا البائية B cells، فقد ارتفعت نسبة مجتمع الخلايا البائية البادئة من 5% إلى 98% بعد الفرز.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنقية مجموعات الخلايا البائية (b-cell) والخلايا التائية (t-cell) من الخلايا الجسدية باستخدام تقنية FACS. وتذكروا أنه يمكن استخدام تقنية FACS لتنقية أي مجموعة خلوية إذا أمكن تحضير معلق خلوي أحادي وكانت الأجسام المضادة المناسبة متوفرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنقية الخلايا المعدلة وراثياً بعلامات فلورية بسهولة دون الحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة.

كذلك، تذكر دائماً استخدام الضوابط المناسبة لتجاربك، وتحقق دائماً من تكوين ليزر قياس التدفق الخلوي للتأكد من استخدام الفلوروكروماات الصحيحة، واحرص على استخدام بوابات مناسبة بحيث تحيط بالمجموعات الخلوية بشكل صحيح. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.