تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

تستخدم هذه العملية التصوير الحي للخلايا لتصور انتقال فيروس HIV المسمى بـ GFP عبر المشابك الفيروسية بين خلايا T لقطط jerk التي تعبر عن HIV وخلايا T أولية غير مصابة. يبدأ مقايسة الانتقال من خلية إلى أخرى بنقل HIV gag IG FP إلى خلايا T لقطط jerk، وهو استنساخ فلوري معدٍ من HIV-1، حيث تعبر خلايا قطط jerk المنقولة عن HIV gag IG FP. بعد ذلك، يتم خلط هذه الخلايا مع خلايا T أولية غير مصابة وموسومة بـ C-M-T-M-R، ثم توضع في غرفة تصوير حيث يمكن ملاحظة انتقال HIV المسمى بـ GFP عبر المشبك الفيروسي.

يتم تحليل البيانات الناتجة باستخدام برنامج لتحليل الصور للكشف عن تفاصيل انتقال HIV عبر المشابك الفيروسية للخلايا التائية. مرحباً، اسمي بنجامين ديل من مختبر بن تشن في قسم الطب بمدرسة ماونت سيناي للطب. اسمي جريج مكنيرني من مختبر الدكتور توماس هيوزر في مركز NSF للبيوفوتونيكس في المركز الطبي بجامعة كاليفورنيا، ديفيس.

وأنا ديانا تومسون، أيضاً من مختبر الدكتور Thomas Huser. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير انتقال فيروس HIV-1 من خلية إلى أخرى باستخدام المجهر البؤري الحي. في هذا الإجراء، يتم ترانسفكشن خلايا Jurkat بنسخة جزيئية معدية من فيروس HIV-1، ويجب أن ينفذ هذا العمل موظفون مختبريون مدربون يعملون في مرافق معتمدة للأمان الحيوي.

يمكن تنفيذ البروتوكول الموضح هنا في غرف زراعة الأنسجة من المستوى الثاني المطور (BSL-2+) أو المستوى الثالث من السلامة البيولوجية (BSL-3). يجب أن تحظى عمليات التعامل مع فيروس HIV المعدي في مرافق التصوير بموافقة مكتب السلامة البيولوجية المؤسسي المحلي. يتم الحفاظ على خلايا jerk cat التي ستُستخدم كخلايا مانحة بتركيز يتراوح بين 2×10⁵ و 8×10⁵ خلية/ملليلتر.

في استزراع خلايا jerk cat، يؤدي تركيز الخلايا في الوسط الذي يتجاوز 8 × 10⁵ خلية/ملليلتر إلى انخفاض في كفاءة عفن التحول (trans efficiency). لبدء الإجراء، قم بنقل البلازميد الفيروسي HIV gag IGFP إلى 5 × 10⁶ من خلايا jerk cat باستخدام طريقة amax nucleo affection كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق، ثم اترك الخلايا لتتعافى طوال الليل. يتم تنقية الخلايا اللمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي من الطبقة الكريمية (buffy coats) للدم البشري الكامل عن طريق طرد مركزي متدرج الكثافة باستخدام FICO.

يتم تنقية خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي عن طريق الاختيار السلبي باستخدام طقم عزل خلايا T الموجبة لـ CD4. تُجمع خلايا T الموجبة لـ CD4 المختارة سلبيًا من عمود مغناطيسي وتُزرع في وسط PMI الخاص بنا مع 10% FPS مضاف إليه 10 units per milliliter من recombinant human IL2. كما يمكن تقسيم خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 المعزولة إلى حصص وتجميدها باستخدام حاويات التجميد المبرد. توضع حاويات التجميد في مجمد بدرجة حرارة -70 °C لمدة لا تقل عن ثلاث إلى أربع ساعات.

تُنقل الخلايا بعد ذلك إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد. والآن، بعد أن تم ترصيف خلايا Jurkat وعزل خلايا T الأولية المستهدفة والموجبة لـ CD4، يتم الانتقال إلى تنظيف الخلايا ووسمها في اليوم التالي للترصيف. تعبر خلايا Jurkat الآن عن بنية HIV الفلورية المعدية.

عند التعامل مع العينات المعدية، نرتدي معطف مختبر يغلق من الأمام وزوجين من القفازات. يتم إزالة الحطام الخلوي من الخلايا المنقولة عن طريق الطرد المركزي فوق وسط fial high pack density. أولاً، يتم توزيع 1.5 milliliters من fial pack في قاع أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، قم بتغطية مادة التدرج برفق باستخدام خلايا HEK293 المنقولة جينياً في حجم 5 mL من وسط PMI الخاص بنا. في هذه المرحلة، تكون خلايا HEK293 المنقولة جينياً قادرة على إنتاج فيروس HIV مُعدٍ. لذا، يجب تعقيم جميع رؤوس الماصات التي تلامس الخلايا التي تعبر عن فيروس HIV باستخدام محلول مبيّض بتركيز 10%.

قبل التخلص من الأنبوب في حاوية داخل كبينة السلامة البيولوجية، قم بتغطية الأنبوب ورش الجزء الخارجي منه بمحلول ethanol بتركيز 70% ومسحه باستخدام منديل kim wipe جاف، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 400 Gs لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكبح. بعد عملية الطرد المركزي، استخدم ماصة لإزالة الخلايا بعناية من الواجهة الفاصلة بين الخلايا والوسط الغذائي، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 milliliter. قم بتخفيف الخلايا باستخدام وسط PMI الخاص بنا حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 GS لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، نقوم بتعليق الراسب في ثلاثة ملليلتر من وسط استزراع jerk hat وننقله إلى بئر بحجم 2 cm في طبق يحتوي على ستة آبار. يوضع الطبق في حضانة استزراع الأنسجة حتى يحين موعد استخدامه في اليوم التالي. وفي مساء اليوم نفسه، يتم وسم خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 المستخدمة كخلايا مستهدفة من أجل تمييزها عن الخلايا المانحة. أولاً، يتم ترسيب 4 × 10⁶ من خلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 عن طريق الطرد المركزي بسرعة 400 Gs لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام 5 mL من PBS وقم بإعادة تعليقها في 2 mL من PBS، ثم أضف cell tracker orange ليصل التركيز النهائي إلى 1.5 µM واحضنها عند 37 °C لعدة دقائق. عند انتهاء فترة الحضن، أضف 8 mL من وسط chica الكامل ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 400 ×g لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الخلايا في ثلاثة مللي لتر من الوسط الغذائي الكامل المدعم بـ 10 وحدات لكل مللي لتر من IL two وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. وبعد الحضانة الليلية، تصبح الخلايا المانحة والمستهدفة جاهزة لتجربة النقل من خلية إلى خلية. وقبل إعداد تجربة النقل من خلية إلى خلية، قم بتجهيز غرفة التصوير لعمل عازل للمنصة ضد تقلبات درجات الحرارة في الغرفة.

ولحجب ضوء الغرفة الخلفي، يتم وضع غطاء أسود كبير فوق إعداد تسخين المجهر بالكامل، مما يؤدي إلى تكوين جيب هوائي معزول حول النظام. ويتم الحفاظ على غرفة التصوير عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 degrees Celsius باستخدام سخان ثرموستاتي مع طرف ميزان حرارة من النوع T thermocouple يوضع بجانب العينة لتغذية راجعة عن درجة الحرارة. يتم التسخين المسبق لمدة 30 minutes قبل تثبيت العينة.

يُستخدم التصوير البؤري بالقرص الدوار باستخدام مجهر ضوئي مقلوب لإنشاء صور بؤرية ثلاثية الأبعاد لعملية انتقال فيروس HIV من خلية إلى أخرى. يتم التحكم في جميع الأجهزة وعمليات الاستحواذ، بما في ذلك منصة Z، بواسطة برنامج IQ الإصدار 1.8، ويتم إجراء المسح بواسطة وحدة التصوير البؤري ذات القرص الدوار CS U 10 التي تستخدم بالتزامن أكثر من 800 نقطة بؤرية لزيادة معدل المسح بشكل كبير بما يتناسب مع سرعتها. تقترن وحدة CS U 10 بكاميرا ذات جهاز اقتران شحني مضاعف للإلكترونات عالية الحساسية للسماح بالتصوير السريع في الإضاءة المنخفضة، مما يقلل من كل من التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

مصدر ضوء الفلوريسنت عبارة عن ليزر غاز أيونات الأرجون والكريبتون متعدد الأطوال الموجية. ويُستخدم مرشح بصري قابل للضبط من نوع An and or Oko (والذي يُرمز له بـ A OTF) لاختيار الأطوال الموجية المطلوبة، وهي 488 nanometers و 568 nanometers في هذه الحالة، مع التحكم في قدرتها لتقليل التبييض الضوئي بشكل أكبر وتمديد وقت التصوير. يقوم الـ A OTF بغلق الليزر سريعاً بعد كل تعرض يستغرق من 15 to 30 millisecond عندما لا تكون الكاميرا في طور التقاط الصور، وذلك لتجنب التعرض غير الضروري أثناء نقل الصور من كاميرا E-M-C-C-D إلى الكمبيوتر.

يتم دمج ضوء الليزر في نظام القرص الدوار باستخدام مرآة Dichroic رباعية النطاق 405 488 568 647، ويتم فصل الانبعاث الفلوري حسب الطول الموجي باستخدام مرآة diic طويلة التمرير 560 nanometer مع مقسم صور. يتم ترشيح القناة الخضراء باستخدام مرشح تمرير نطاق 525 over 50 nanometer، بينما يتم ترشيح القناة الحمراء باستخدام مرشح تمرير نطاق 609 over 54 nanometer. ويتم عرض القناتين جنباً إلى جنب على كاميرا E-M-C-C-D.

بينما يتم تسخين غرفة التصوير، قم بتجهيز الخلايا لتجربة النقل من خلية إلى أخرى. استخدم مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لعد خلايا ette التي تعبر عن HIV gag IGFP. ضع مقياس كرات الدم في طبق بتري لتجنب التعرض المباشر للخلايا التي تعبر عن الفيروس.

اغسل الخلايا باستخدام وسط غذائي مستقل عن ثاني أكسيد الكربون، وأعد تعليقها في وسط تصوير الخلايا الحية بتركيز يتراوح من 1 إلى 3 × 10⁷ خلية لكل ملليلتر. إن استخدام وسط غذائي مستقل عن ثاني أكسيد الكربون يلغي الحاجة إلى وجود غرفة بيئية تحتوي على ثاني أكسيد الكربون لأغراض التصوير.

قم أيضاً بعدّ وغسل وإعادة تعليق خلايا T الأولية الموسومة والموجبة لـ CD4 كما تم توضيحه للتو بالنسبة لخلايا Jurkat. بعد ذلك، ابدأ عملية النقل من خلية إلى خلية بخلط 20 µL من خلايا Jurkat التي تم نقل HIV gag IGFP إليها مع 40 µL من خلايا T الأولية الموسومة والموجبة لـ CD4، ثم حمّل 50 µL في غرفة EBD دقيقة نفوذة للغاز ومعالجة للزراعة النسيجية. أغلق الغرفة باستخدام السدادات وثبّتها بلف واجهة الربط بين السدادة وغرفة EBD بفيلم البارافلم.

امسح غرفة التصوير باستخدام منديل كيميائي مبلل بـ 70%ethanol واتركه ليجف في الهواء لفترة وجيزة داخل غطاء السحب. انقل غرفة التصوير المحكمة الإغلاق في حاوية مغلقة لتجنب التعرض العرضي. في حال سقوط الغرفة أثناء النقل، وبعد تحميل غرفة تصوير IBD بالخلايا مباشرة، قم بتركيب الجهاز على المجهر.

التقط صوراً لأزواج الخلايا باستخدام عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 60 x 1.42 NA، حيث أن الفتحة العددية العالية تعمل على تحسين الدقة بشكل كبير لزيادة سرعة الحصول على مجموعات الصور ثلاثية الأبعاد (3D image stacks). قم بقص منطقة التسجيل في كاميرا EM CD لتقتصر على المنطقة الملاصقة لزوج الخلايا. علاوة على ذلك، قد تساعد خطوة Z كبيرة تتراوح بين 0.45 و 0.75 micrometers في تسريع عملية الحصول على الصور في ظل هذه الظروف.

يتم تسجيل الصور باستمرار على فترات تتراوح من 20 إلى 60 دقيقة. ويمكن أن يمتد التصوير المتكرر لنفس نقطة العينة لمدة تصل إلى ست ساعات مع حدوث حد أدنى من التبييض الضوئي عند الالتقاط. وتتكون كل شريحة بيانات من عشرات الآلاف من الصور التي قد تشغل مساحة إجمالية تتراوح من 5 إلى 20 جيجابايت.

لتسهيل نقل وتحليل الملفات الكبيرة، يتم تقسيم كل ملف وتصديره على شكل أجزاء من ملفات صور TIFF بحجم جيجابايت واحد. ولتحليل الصور المكتسبة، استخدم أيًا من البرامج المتعددة لتحليل الصور. ارجع إلى البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تفاصيل تحليل الصور، بما في ذلك تصحيح تبييض الكثافة والتتبع التلقائي واليدوي لنقاط gag.

خلال 10 إلى 15 دقيقة من الخلط، يمكن رؤية خلايا jerk cat التي تعبر عن HIV gag IGFP وهي تلتصق بخلايا T الأولية الموجبة لـ CD4 عبر التصوير. ومن خلال هذه المترافقات، يمكن تقييم تحركات نقاط gag في الخلايا المصابة وكذلك في الخلايا المستهدفة. وبعد تشكل المشبك، وفي غضون 30 دقيقة إلى ثلاث ساعات، يمكن ملاحظة انتقال نقاط gag IG FP إلى الخلايا المستهدفة المميزة بـ cell tracker.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصور انتقال فيروس HIV من خلية إلى أخرى بين الخلايا التائية. عند تنفيذ هذه الإجراءات، من المهم جدًا تذكر مراعاة جميع احتياطات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية بلس (biosafety level two plus) أو المستوى الثالث من السلامة البيولوجية (biosafety level three) عند التعامل مع العينات التي تعرضت لخلايا تعبر عن فيروس HIV. تذكر أيضًا استخدام خلايا JCA مصانة جيدًا وحمض DNA خالي من السموم الداخلية لتحسين عملية عفن الخلايا (transfection).

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.