الأبهر خاتم الفحص

يتمثل الهدف العام من مقايسة الحلقة الأبهرية في توفير نظام تجريبي مرن يتم فيه إنبات الأوعية الدموية من قطع كاملة من الشريان الأبهر للفأر داخل مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D matrix). ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تشريح الشريان الأبهر الصدري من الفأر، ثم تنظيفه بعناية من أي أنسجة محيطة متبقية. توضع شرائح من الشريان الأبهر النظيف أو حلقات أبهرية في آبار فردية من طبق يحتوي على 48 بئراً، حيث يحتوي كل بئر على مستخلص المصفوفة الأساسي أو BME مشكلاً على هيئة قباب.

تؤدي إضافة قطرة إضافية من BME إلى إحاطة الحلقة في بنية ثلاثية الأبعاد. ويمكن أن تحتوي المصفوفة على أي كاشف تجريبي مختار. بعد الحضن لعدة أيام، يمكن ملاحظة تبرعم الأوعية من حلقات الأبهر، وبذلك يمكن تقييم القدرة الوعائية للمركبات المختبرة.

مرحباً، أنا كارين بين من مختبر الدكتور إي. لويس في قسم الكيمياء الحيوية السريرية بجامعة بيون السلبية في بئر السبع، إسرائيل. سنعرض لكم اليوم إجراءً خاصاً بمقايسة الحلقة الأبهرية للفئران. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات المواد المختلفة على تكوين الأوعية الدموية.

لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، اترك مستخلص الغشاء القاعدي (BME) ليذوب على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C. وبمجرد ذوبانه، استمر في الحفاظ على BME بارداً لمنعه من التصلب مرة أخرى.

في يوم التجربة، يتم تخدير فأر يتراوح عمره بين ستة إلى سبعة أسابيع عن طريق حقن ketamine و xylazine وفق المعايير القياسية، ثم سحب الدم بسرعة من الشرايين الرقبية، متبوعاً بخلع فقرات الرقبة. ابدأ الإجراء بمسح الحيوان بـ 70% ethanol داخل غطاء تدفق صفائحي معقم. بعد ذلك، وأثناء العمل تحت مجهر تشريحي، استخدم ملاقط ومقصات تشريح معقمة لإجراء شق رأسي في الجلد وفتح الجدار البريتوني.

يجب إجراء الشق للكشف عن الجزء العلوي من عظم القص حيث يتم أيضاً قص القفص الصدري وإزالة الحجاب الحاجز. تابع بدفع جميع الأعضاء جانباً بعناية للكشف تماماً عن الأبهر الصدري الموجود بجانب العمود الفقري، وعندما يصبح الأبهر مكشوفاً، أدخل ملقطاً عقيماً رفيعاً بين الأبهر والعمود الفقري. افتح الملقط وارفع الأبهر تدريجياً من مكانه، مع فصل الجزء الصدري عن بقية الأبهر.

بعد فصل الشريان الأبهر، استخدم مقصاً حاداً لقطعه من الفأر بدءاً من الطرف القريب من الأوعية الكلوية وصولاً إلى منطقة القلب. ضع الشريان الأبهر الصدري المستأصل في أطباق بتري مملوءة بـ PBS بارد ومعقم. الآن وبعد إزالة الشريان الأبهر، يمكن تحضير الحلقات الأبهرية باستخدام ملقطين معقمين والعمل تحت مجهر ثنائي العينية.

قم بتنظيف الشريان الأورطي الصدري من الأنسجة الدهنية المحيطة. تأكد من عدم إتلاف الشريان الأورطي وأمسكه من الحواف فقط. يجب غمر الشريان الأورطي بشكل متكرر في طبق بتري الذي يحتوي على PBS لمنع الجفاف حتى يتم تنظيفه نهائياً.

بعد تنظيف الأبهر الصدري، استخدم شفرة جراحية وتحت المجهر ثنائي العينين لتقطيع الأبهر بالتساوي إلى حلقات يبلغ سمك كل منها 1 mm. وباستخدام مسطرة موضوعة أسفل سطح القطع كدليل، تأكد من استخدام شفرة جديدة واستبدالها من حين لآخر للحفاظ على حدتها. لا تُستخدم أطراف الأبهر. بعد قطع كل حلقة، استخدم ملقطاً لنقلها برفق شديد إلى طبق جديد يحتوي على PBS بارد.

ضع جميع الحلقات في طبق واحد يحتوي على PBS لضمان عشوائية المقايسة. وبما أن كل جزء من الشريان الأورطي يمتلك قدرة تباينية على تكوين الأوعية الدموية، فاحتفظ بالحلقات على الثلج. بعد ذلك، قم بتجهيز طبق المقايسة باستخدام رؤوس ماصات مبردة مسبقاً.

أضف إلى كل بئر في طبق مكون من 48 بئراً قطرة تبلغ حوالي 150 µL من BME البارد، حيث تتصلب القطرة لتصبح على شكل قبة أثناء الحركة. يسمح BME بنقل المواد، والجاذبية الكيميائية للخلايا، والأهم من ذلك، تمايز الخلايا وهجرتها التي تؤدي إلى تكوين أوعية دموية جديدة. يتم ملء الآبار المحيطة بـ PBS لتجنب جفاف BME، واترك قطرة BME لتتصلب عند 37 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. بمجرد تصلب BME، ارفع بعناية حلقة أبهريّة من طبق بتري باستخدام الملاقط، ومن أجل منع التلف، يجب نقل الحلقة داخل قطرة من الدهون تتكون بين طرفي الملقط نتيجة التوتر السطحي للسائل. ضع حلقة أبهريّة واحدة في المركز العلوي لكل قبة واتركها في الحاضنة لمدة 10 دقائق عند 37 °C. أضف فوق كل حلقة 150 µL إضافية من BME واتركها في الحاضنة لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة.

عند درجة حرارة 37 درجة Celsius، تصبح الحلقة الآن مغلفة بـ BME والتحليل. يمكن إضافة المواد إلى الطبق لبدء التحليل. قم بتعزيز وسط خالي من المصل للخلايا البطانية البشرية المحضر مسبقاً إما بالمادة التجريبية أو بمكمل نمو الخلايا البطانية كعنصر تحكم إيجابي أو عنصر تحكم سلبي.

استخدم الوسط الغذائي وحده. أضف 500 µL من الوسط المكمل المسبق إلى كل بئر، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة تتراوح من 6 إلى 12 يوماً. خلال فترة التحضين هذه، افحص الطبق تحت المجهر وابحث عن الأوعية النابتة من الأبهر وعن الأوعية الناضجة المتقدمة التي يتم التعرف عليها من خلال تفرعات الأوعية الإضافية.

يجب تمديد الأنسجة من الحلقة وتصوير الحلقات ثلاثياً بين اليوم السادس والثاني عشر باستخدام مجهر ستيريوفوني بتباين طوري قياسي. بالإضافة إلى ذلك، يتم جمع السوائل الطافية في أيام مختلفة بين اليوم السادس والثاني عشر وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام خلال يوم واحد، أو تخزينها عند -20 أو -80 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي. يمكن تحليل السوائل الطافية باستخدام تقنيات مختلفة مثل مقايسة Eliza لبروتين vgf أو مقايسة grease لقياس مستويات أكسيد النيتريك.

جُمعت هذه الصور بعد 12 يوماً من وضع الحلقات في الآبار والتحضين إما مع المزرعة أو الوسط (كما يظهر في الصف العلوي من الصور) أو ECGS المستخدمة كعنصر تحكم إيجابي لبرعمة الأوعية (كما يظهر في اللوحة السفلية). وتمثل كل صورة لقطة نموذجية لأربعة من أصل 12 حلقة، وهو العدد الذي يُستخدم عادةً في المقايسة لكل حالة.

يظهر ركن كل حلقة أبهريّة في كل بئر منفصلة باللون الأسود. عند التصوير بهذه الطريقة، تُظهر الحلقات الأبهرية التي تعرضت لـ ECGS نمواً وعائياً، وتشير الأسهم إلى عدد من الأوعية الكثيرة التي تكونت. يتم تمييز كل وعاء على أنه سلاسل من الخلايا البطانية مع تفرعات عرضية تشير إلى أنها ناضجة.

لا يمكن ملاحظة أي أوعية نابتة في المزرعة. آبار الوسط في اللوحة العلوية، لقد شرحنا لك للتو كيفية إجراء مقايسة الشريان الأبهر عند القيام بهذا الإجراء. من المهم تذكر العمل بدقة وتحت ظروفهم.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.