رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

تعد ذبابة الفاكهة Drosophila جذابة وراثياً لإجراء تحقيقات حول تطور القلب ووظيفته ونشاط منظم ضربات القلب الكامن. يوضح هذا الإجراء كيفية إعداد تحضيرات من اليرقات السليمة والمشرحة، وكيفية مراقبة معدل ضربات القلب. كما يسمح التحضير المشرح بتسجيل الجهود خارج الخلوية أو داخل الخلوية لمزيد من الوصول إلى وظيفة القنوات الأيونية.

مرحباً، أنا روبن كوبر، عضو هيئة تدريس في قسم الأحياء بجامعة كنتاكي. سيقوم طلابي اليوم، آن كوبر، وكايلا ريمان، ومات وارد، وإيستر بوكو، بعرض إجراءات مختلفة لمراقبة معدل ضربات القلب في يرقات Drosophila. تُسمى الطريقة التالية غير المقيدة بطريقة "مزرعة النمل" لأن اليرقات يتم تصويرها ضمن مستوى بؤري واحد.

لأفضل رؤية للييرقات، استخدم مجهراً تشريحياً بعدسة شيئية أساسية بقوة 2x وعدسة أنبوبية بقوة 0.5x لتحقيق أفضل دقة مكانية وتكبير لمساحة مستطيلة تبلغ 1 سنتيمتر في 0.5 سنتيمتر. يمكن تسجيل الصور ومقاطع الفيديو عبر كاميرا مثبتة على العدسة العينية. لبدء هذه الطريقة، ضع اليرقة بين شريحتين زجاجيتين مع طبقة رقيقة من الغذاء.

يتم تثبيت الشرائح بحيث تكون المسافة بينها من 1 إلى 1.5 مليمتر باستخدام فواصل بلاستيكية على الجوانب الأربعة. قم بإمالة العينة بزاوية تتراوح بين 20 و 45 درجة لبضع دقائق لتحفيز اليرقة على إبقاء رأسها متجهاً للأسفل. اضبط مرآة المجهر للحصول على أفضل تباين للقلب أو القصبتين الهوائيتين لمراقبة ضربات القلب.

تعد طريقة الغراء وسيلة تثبيت دائمة لتقييد اليرقات على شريحة زجاجية. لبدء طريقة الغراء، ضع غطاء شريحة نظيفًا فوق شريحة زجاجية، ثم ضع قطرة صغيرة من الغراء القوي (super glue) على أحد أركان غطاء الشريحة.

بعد ذلك، اشطف اليرقات بالماء. ولإزالة الطعام الزائد، امتص السائل باستخدام منديل ورقي أو طرف منشفة ورقية. وبمجرد شطف اليرقة جيداً، التقطها برفق باستخدام ملقط نظيف وضعها على الشريحة بعيداً عن غطاء الشريحة تحت المجهر، مع توجيه اليرقة بحيث تكون على بطنها.

ستظهر على المعدة أخاديد أفقية باهتة تمتد على طولها مع وجود شعيرات سوداء دقيقة. يجب أن يكون ظهر اليرقات متجهًا للأعلى ويتميز بوجود خطين متوازيين يمثلان القصبات الهوائية. باستخدام مجموعة ثانية من الملاقط المخصصة حصريًا للتعامل مع الغراء، خذ كمية صغيرة من القطرة الموجودة في نهاية الشريحة وضعها عند الزاوية في الجانب المقابل.

استخدم كمية ضئيلة تكفي فقط لتغطية رأس الملقط. التقط الحيوان وضعه على الغراء مع التأكد من بقاء الجانب البطني للأسفل باتجاه الفوهة السوداء.

يجب أن تكون الخطاطيف عند حافة غطاء الشريحة أو بالقرب منها، وكذلك خطاطيف الفم واللولب البني. يجب ألا تلامس الغراء. اضغط برفق على اليرقة لتسطيحها.

لتطبيق المادة المختبرة، يفضل توزيع قطرات صغيرة باستخدام حقنة بالقرب من رأس اليرقة. يتم رصد معدل ضربات القلب عن طريق عد عدد مرات نبض الحلزونات في الدقيقة الواحدة. ولإجراء ملاحظات لفترات أطول، يمكن تغذية اليرقات في مكانها وترطيبها لمنع الجفاف. ولصنع لوح تشريح صالح للاستخدام تحت المجهر، استخدم مشرطاً لقطع ثقب بقطر 2 cm في مركز قطعة من الشريط المغناطيسي ثم ألصقها بشريحة زجاجية.

استخدم دبابيس تشريح تم ثنيها ولصقها بمشابك ورقية لتسهيل عملية التثبيت. أثناء التشريح، ضع يرقات نجمية في مرحلة الثلث الثالث السليمة على لوح التشريح. مع توجيه الجانب الظهري للأعلى، يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية من خلال الجلد الخارجي.

ضع دبوسين في اليرقات على جانبي خطافات الفم، ودبوسين آخرين على جانبي الحلزونات. بعد ذلك، أضف المحلول الملحي للحفاظ على رطوبة اليرقات. ثم قم بإجراء شق أفقي عند الطرف الملتف، يليه قطع طولي يستمر بمحاذاة الحلزونات باتجاه رأس الحيوان.

ارفع دبوساً ظهرياً واحداً وقم بتعليقه أسفل القشيرة. استخدم الدبوس للتوسيع. افتح تجويف الجسم.

كرر العملية مع الدبابيس الثلاثة الأخرى. بمجرد تثبيت الحيوان وهو مفتوح، قم بإزالة الأحشاء مع الحرص على عدم إتلاف الرغامي أو القلب. ترتبط بعض التراكيب، بما في ذلك الدماغ وبعض الأجسام الدهنية، بالقلب وسوف يتضرر القلب عند إزالتها.

اترك التحضير ليرتاح في حمام محلول ملحي HL three لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق بعد التشريح؛ حيث يتم إجراء التسجيلات داخل الخلوية والميدانية في هذا التحضير مع تطبيق العوامل الدوائية مباشرة على القلب. يستغرق إجمالي وقت خطوة التشريح هذه من ثلاث إلى ست دقائق. لإجراء التنبيه الكهربائي، يجب أولاً تجهيز أقطاب كهربائية بؤرية؛ وذلك بتمرير قطب زجاجي فوق عنصر تسخين لصقله بالنار وعمل ثنية تدريجية بزاوية 45 درجة تقريباً، ثم قم بتثبيت القطب البؤري المملوء بمحلول ملحي HL three بدرجة حرارة الغرفة في جهاز التحكم (manipulator) بحيث يكون الطرف متجهاً لأسفل.

تأكد من ملامسة سلك المحفز للمحلول الملحي داخل القطب ومن أن المحفز في وضع الإيقاف. قم بتثبيت تحضير حديث لتشريح القلب على المجهر. ضع سلك التأريض في المحلول الملحي.

مع الحرص على عدم لمس الدبابيس أو إزعاج التحضير. حافظ على تركيز الرؤية على القطب الكهربائي أثناء استخدام جهاز التحكم لتحريكه لأسفل في المحلول الملحي. وبمجرد وصوله إلى المحلول الملحي، ضع طرف القطب بحيث يكون اللمعة مسطحة مقابل القلب وتلامسه بخفة.

بمجرد وضع القطب الكهربائي، اضبط تردد جهاز التحفيز عند 2 hertz مع ضبط الجهد الكهربائي على أدنى إعداد له. قم بتشغيل جهاز التحفيز. ثم اضبط التردد ليكون حوالي 3 hertz وزد الجهد الكهربائي ببطء حتى تزداد سرعة ضربات القلب لتتوافق مع إيقاع جهاز التحفيز.

يمكن الآن التحكم في النظم عن طريق جهاز التحفيز. كما يمكن إضافة مركبات لمعرفة ما إذا كانت تؤثر على الانقباض أو التوصيل الكهربائي. لإجراء تسجيلات الجهد الميداني، املأ قطب تسجيل الماكرو باتش (macro patch) بالوسط الاستحماني وثبته في جهاز تحكم دقيق على مجهر مركب.

قم بتوصيل القطب الكهربائي بمضخم وجهاز تسجيل. استخدم الموجه لخفض تجويف القطب الكهربائي فوق قلب عينة تشريح مثبتة بالمجهر. المس القلب بطرف القطب الكهربائي بلطف شديد.

يمكن الآن إجراء تسجيلات ميدانية لتسجيل الجهود الميدانية من منطقة أخرى من القلب. ارفع طرف القطب الكهربائي برفق وحركه إلى منطقة جديدة باستخدام الملاعب، ثم ابدأ مجدداً في تسجيلات الجهد الميداني للطرف. يتيح ذلك مراقبة دقيقة لمعدل ومدة الإشارات الكهربائية في القلب لقياس الجهود عبر الغشائية للخلايا العضلية القلبية في اليرقات.

أولاً، تأكد من أن تجويف قطب كهربائي حاد مملوء بـ 3 molar potassium chloride مسطح تماماً مقابل القلب بزاوية 45 درجة تقريباً من الوضع العمودي. وبمجرد تحديد الموضع بشكل صحيح، المس القلب برفق بطرف القطب الكهربائي ثم أدخل الطرف في خلية. يمكن إعادة استخدام القطب الكهربائي إذا لم يكن مكسوراً.

تسمح التسجيلات داخل الخلوية بقياس الأساس الأيوني لجهد الفعل والأشكال المميزة للجهود لفحص تأثيرات طفرات القنوات الأيونية أو معدلات القنوات. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تسجيلات القلب، بالإضافة إلى كيفية قياس الجهود داخل الخلوية وجهود المجال. يمكنك استخدام هذه التقنيات لدراسة التغيرات القلبية، بالإضافة إلى التدخلات الدوائية والتعديلات الجينية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم عدم سحب أي بنية مرتبطة متصلة بالقلب أو الضغط بقوة مفرطة باستخدام القطب البؤري. كذلك عند استخدام طريقة اللصق، يجب الحرص على عدم لصق الفم أو الكرة بحيث تُغلق. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا بالتوفيق في تجاربكم.