تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة

سيتم عرض تقنيتين هنا لتصوير قلب نابض في ذبابة Drosophila من أجل تشريح قلب الذبابة البالغة. أولاً، يتم إزالة الرأس والصدر عن طريق قطع واحد على طول الخط الموضح. بعد ذلك، يتم إزالة الأعضاء التناسلية وفتح تجويف الجسم البطني باستخدام الملاقط، ثم يتم إزالة الأمعاء، وفي حالة أنثى الذبابة، يتم إزالة المبيضان.

يتم شفط الجسم الدهني البطني في القطعتين البطنيتين الثالثة والرابعة بعناية للكشف عن قلب الحشرة البالغة من أجل تثبيت قلب اليرقة. يتم تثبيت يرقة واحدة موضوعة في محلول منظم عن طريق وضع غراء histo acral أولاً حول منطقة رأس اليرقة. تُمد اليرقة بلطف ويُوضع المزيد من الغراء على النهاية الخلفية، ثم على جانبي جدار جسم اليرقة.

مرحباً، أنا جي فلير. ومرحباً، أنا كارين إير. نحن عضوان في برنامج التطور والشيخوخة في معهد بيرنهام للأبحاث الطبية.

سنعرض لكم اليوم الإجراءات التي طورناها لتصوير القلب النابض ليرقات وذباب الفاكهة البالغ من نوع drosophila. نستخدم كلا التحضيرين كوسيلة لتصوير وفحص وقياس معايير ضربات القلب في ذبابة الفاكهة Drosophila. وقبل البدء، نقوم أولاً بتحضير محلول لمف دموي اصطناعي.

يحتوي هذا المحلول على مادة السكروز، والتي يجب إضافتها إلى اللمف الدموي الاصطناعي من المحاليل المخزنة المبردة مباشرة قبل الاستخدام. ومن أجل منع التلوث البكتيري، يتم رفع درجة حرارة اللمف الدموي الاصطناعي إلى درجة حرارة الغرفة وأكسجة المحلول عن طريق فقاعات الهواء لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، يتم سحب عدة شعيرات دقيقة باستخدام جهاز سحب الماصات القياسي، والتي ستكون مطلوبة لإزالة الأجسام الدهنية في الذبابة.

بمجرد تحضير كل شيء، يجب تخدير الذباب البالغ. يمكن القيام بذلك عن طريق تعريض الذباب لمادة fly nap لفترة وجيزة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق، مع الحرص على عدم ترك الذباب في fly nap لأكثر من خمس دقائق. يمكن أيضاً استخدام التعرض قصير المدى للبرد لتخدير الذباب، ولكن لا يُنصح باستخدام ثاني أكسيد الكربون نظراً لآثاره طويلة الأمد على معدل ضربات القلب والقدرة.

بعد ذلك، توضع الذباب المخدرة بحيث يكون الجانب الظهري لأسفل في طبق بتري مغطى بطبقة رقيقة من الفازلين. يجب أن تلتصق القُطَيْعة الكارهة للماء الموجودة في الأجنحة والجسم بالفازلين بشكل عكسي، ولكن يمكن إعادة وضع الذبابة إذا لزم الأمر. يتم إجراء قطع أولي باستخدام مقص زنبركي منحني.

يتم ذلك عن طريق وضع شفرات المقص تحت أرجل الذبابة وبزاوية مائلة للأسفل باتجاه السطح الظهري بالقرب من الرقبة. يتم إزالة الرأس والحبل العصبي البطني والأرجل بقطعة واحدة بمجرد القص. ثم يتم غمر التحضير في محلول الهيموليمف الاصطناعي المؤكسج باستخدام مقصات زنبركية.

يتم إزالة الطرف الخلفي للبطن، والذي يتكون من القطعتين البطنيتين السابعة والثامنة، بقطع واحد. يوفر هذا الإجراء إمكانية إجراء قطوع جانبية على طول كلتا حافتي البطن، ويعمل على قطع الاتصال بين المعي الخلفي والكيوتيكل البطني. أدخل شفرات المقص في الفتحة الصغيرة الموجودة في طرف البطن وقم بقص الكيوتيكل جانبياً.

يؤدي ذلك إلى تحرير إحدى حواف القشيرة البطنية. أمسك بالطية باستخدام الملقط واصنع قطعاً مماثلاً على طول الحافة الجانبية المقابلة للبطن. يمكن الآن إزالة الطية المتحررة من القشيرة البطنية.

يمكن عادةً إزالة الأمعاء والأعضاء البطنية الأخرى ككتلة واحدة باستخدام ملاقط الجواهر والشد اللطيف. ويكشف إزالة الأعضاء الداخلية عن أنبوب القلب النابض، والذي لا يزال متصلاً بالكيوتيكل الظهري بواسطة عضلات شريانية صغيرة ومحاطاً بأجسام دهنية. يتم إدخال الشعيرات المسحوبة في أنبوب بلاستيكي بقطر 1/16 بوصة متصل بمصدر تفريغ.

تتناسب قوة الشفط طردياً مع قطر الطرف، لذا يجب عدم استخدام الماصات ذات الأطراف التي يزيد قطرها عن 40 ميكرون بمجرد إعدادها. يُستخدم نظام الشفط هذا لسحب الدهون الزائدة من حول أنبوب القلب، كما يمكن استخدامه أيضاً لإزالة الفقاعات الهوائية التي تتراكم حول القشيرة وأي شوائب.

يجب توخي الحذر الشديد لتجنب لمس القلب نفسه، وبما أن الجزء الخلفي من القلب هش للغاية، فيجب تجنب تلك المنطقة أيضاً. أصبح أنبوب قلب ذبابة الفاكهة البالغة مكشوفاً الآن ويجب أن يكون نابضاً إذا لزم الأمر. يمكن إعادة وضع القشيرة والقلب المتصل بها عن طريق رفع القشيرة برفق من الفازلين ثم ضغطها لأسفل مرة أخرى بعناية.

تجنب أي تلامس مع أنسجة القلب. في هذه المرحلة، يجب استبدال المحلول الذي يغمر العينة بدم لمفاوي اصطناعي جديد. يجب ترك هذه العينة لتصل إلى حالة التوازن لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة مع التزويد بالأكسجين قبل إجراء أي عمليات.

إذا كان من المقرر الحفاظ على التحضير لفترة تزيد عن 60 دقيقة، فيجب إعادة ترويته بدم ليمفاوي اصطناعي طازج. هذا التحضير جاهز الآن للاستخدام في التسجيل الضوئي، ويمكن استخدامه أيضاً للتسجيل الفيزيولوجي الكهربائي أو للمعالجات النسيجية. ثمة تقنية مختلفة مطلوبة لتصوير نبض القلب داخل اليرقات.

أولاً، قم بتجهيز شرائح التغطية في اليوم السابق للإجراء. يتم ذلك باستخدام عود أسنان لنقل حوالي 50 إلى 70 µL من محلول Sard إلى شريحة تغطية مقاس 22 by 22 millimeter. اترك syl guard ليتصلب عند درجة حرارة 65 °C طوال الليل.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول Brody and Bates المنظم؛ وبمجرد تحضيره، يمكن تخزين الأجزاء في درجة حرارة 20- درجة مئوية وإذابتها عند الحاجة. أخيرًا، قم بتجهيز الأدوات اللازمة لوضع غراء histo acral. أولاً، اسحب عدة شعيرات دقيقة.

بعد ذلك، قم بتوصيل طرف ماصة سعة 1.5 مل بأنبوب بلاستيكي صغير بقطر حوالي 1/32 بوصة. ومن خلال إدخال الطرف الأصغر في الأنبوب، أدخل أنبوبًا شعريًا بحيث تكون فتحته الواسعة باتجاه الطرف الآخر. وبمجرد إتمام الإعداد، قم بتعبئة الأنبوب الشعري بصمغ الأنسجة (histo glue) عن طريق غمس الأنبوب الشعري في قطرة من الصمغ وسحبه برفق نحو الطرف البلاستيكي.

عند العمل بالغراء، يجب أن يكون لدى الباحث أنبوب شعري زجاجي ثانٍ لإزالة الغراء الزائد من طرف الأنبوب الشعري الخاص بالغراء. يظل الغراء سائلاً حتى يتلامس مع المحلول الملحي المنظم حيث يتصلب في غضون ثانيتينين. ومع ذلك، فإنه عادةً ما يظل في حالة لدن لفترة كافية تسمح بإزالته من طرف الأنبوب الشعري للغراء أو أثناء تطبيقه على العينة.

لبدء عملية تثبيت اليرقات، ضع قطرة من غراء histo acral بالقرب من كل زاوية من زوايا أغطية syl guard. أضف 50 microliters من محلول B and B buffer إلى قطرات الغراء، والتي ستتصلب على الفور، ثم املأ المساحة بين النقاط المغلّاة بمحلول b and b. سيعمل الغراء على إبقاء المحلول المنظم على الشريحة.

خذ يرقة في المرحلة الثالثة (L3) في مرحلة التجوال وضعها على قطعة من ورق المناديل المبلل فوق الثلج لمدة دقيقتين؛ حيث سيؤدي ذلك إلى إبطاء حركتها. بعد ذلك، انقل اليرقة إلى المحلول المنظم وقم بتوجيهها بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى.

هذا هو جانب اليرقات الذي يفتقر إلى الأحزمة المتماثلة. ضع بعض الغراء بسرعة بين منطقة الرأس وواقي العتبة. سيتصلب الغراء بسرعة كبيرة ويمنع رأس اليرقات من الحركة.

باستخدام الملقط، أمسك الحيوان بعناية من النهايات الخلفية وقم بمدّه برفق. ثبّت اليرقات في هذا الوضع بوضع الغراء على طول كلا جانبي اليرقات في النصف الخلفي. وللحد من حركة القشيرة الإضافية التي تسببها عضلات جدار الجسم، أضف المزيد من الغراء إلى جوانب الحيوان.

تم الآن تثبيت اليرقة في هذا الوضع. يمكن وضع شريحة الغطاء في طبق بتري صغير مملوء بدم ليمفاوي اصطناعي أو محلول PBS، وبذلك يمكن الآن تسجيل ضربات القلب دون تداخل من حركات جدار الجسم. سيبقى قلب ذبابة الفاكهة البالغ شبه السليم ينبض بشكل إيقاعي لساعات بعد عملية التشريح عند الحفاظ عليه في دم ليمفاوي اصطناعي طازج ومؤكسج.

يظهر هنا مثال تمثيلي، وكذلك في الفيديو التكميلي الأول، لقلوب يرقات في طور النجمة الثالث، والذباب اليافع الذي يتراوح عمره بين أسبوع واحد إلى ثلاثة أسابيع بعد الفقس، حيث يُظهر عموماً نبضات قلب منتظمة بمعدلات تتراوح بين 1 إلى 3 هيرتز. أما الذباب الذي يتجاوز عمره ثلاثة أسابيع فغالباً ما يكون أكثر عدم انتظام في النبض. ومع ذلك، لا تزال هذه القلوب قادرة على النبض تلقائياً لساعات في لمف دم اصطناعي مؤكسج. أما قلوب الذباب البالغ التي تتضرر نتيجة لإجراء التشريح، فعادةً ما تظهر مناطق موضعية من التضيق الشديد التي تعجز عن الارتخاء وغالباً ما تنبض بشكل غير منضبط. ونادراً ما تُلاحظ معدلات ضربات قلب أبطأ من 1 هيرتز في الذباب الذي يقل عمره عن ثلاثة أسابيع.

وبناءً على ذلك، تُعتبر هذه التحضيرات تالفة ويتم التخلص منها. لقد شرحنا للتو كيفية تحضير قلوب ذباب الفاكهة في مرحلة اليرقة ومرحلة البلوغ للتصوير البصري. تذكر أنه عند إعداد التحضير شبه السليم، يجب عدم لمس القلب نفسه مطلقاً.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.