الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

تُعد البروتوميات السريرية تخصصاً جديداً وهاماً يبشر باكتشاف المؤشرات الحيوية التي ستكون مفيدة في التشخيص المبكر للأمراض والتنبؤ بسيرها. نورد هنا طريقة جديدة للموائع الدقيقة الرقمية (DMF) تدمج عدة خطوات معالجة مستخدمة في البروتوميات السريرية، بما في ذلك استخلاص البروتين، وإعادة الإذابة، والاختزال، والألكلة، والهضم الإنزيمي. تستخدم تقنية DMF قطيرات دقيقة منفصلة من بروتينات العينة على مصفوفة من الأقطاب الكهربائية، ويمكن تشغيلها في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح بإجراء تحليل مؤتمت ومتوازٍ للعينات.

تمثل هذه المنهجية تقدماً ملحوظاً مقارنة بالطرق التقليدية، وتمتلك القدرة على أن تكون أداة جديدة ومفيدة في مجال البروتوميات السريرية. مرحباً، أنا ستيف شي من مختبر البروفيسورة إيرين ويلر في قسم الكيمياء ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية بجامعة تورنتو. مرحباً، أنا غابرييل من مختبر ويلر بجامعة تورنتو.

وأنا فيفيان لوك، من مختبر ويرر أيضاً بجامعة تورنتو. وأنا إيرين ويلر، وأنا محظوظة بالعمل مع ستيف ميس وفيفيان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للمعالجة البروتومية باستخدام الموائع الدقيقة الرقمية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البروتينات والعينات البيولوجية. لذا، فلنبدأ.

ابدأ الإجراء داخل خزانة استخلاص الغازات عن طريق تنظيف الركائز الزجاجية في محلول بيرانا (Piranha solution). يتكون محلول بيرانا، مع ضرورة ارتداء أدوات الوقاية المناسبة، من حمض الكبريتيك المركز إلى بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30% بنسبة ثلاثة إلى واحد. لذا يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل معه.

يُنقع الركائز الزجاجية في محلول piranha لمدة 10 دقائق، وبعد التنظيف، تُشطف بالماء منزوع الأيونات أو المقطر ثم تُجفف الركائز باستخدام غاز النيتروجين. توضع الركائز داخل غرفة التبخير بحزمة الإلكترونات لترسيب الكروم بسمك 250 nanometers. تُخرج الركائز من الغرفة بمجرد الوصول إلى هذا السمك وتُشطف بـ isopropanol، ثم تُجفف على لوح تسخين لمدة خمس دقائق عند 115 °C.

قم بتهيئة الركائز المجففة باستخدام hexa methyl xylazine أو HMDS عن طريق الطلاء الدوراني لمدة 30 ثانية. ثم قم بالطلاء الدوراني مرة أخرى بسرعة 3000 RPM باستخدام Shipley S 1811 photo Resist مع اتباع المعايير ذاتها.

قم بخبز الركيزة مسبقاً مباشرة على لوح تسخين عند 100 درجة مئوية لبضع دقائق. ثم قم بتشكيل المقاوم الضوئي عن طريق التعريض للأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع UV لمدة خمس ثوانٍ من خلال قناع ضوئي. بعد ذلك، قم بتظهير الركائز المعرضة للأشعة فوق البنفسجية في مطور Shipley MF 3 21 بكمية كافية لغمر الركيزة لمدة ثلاث دقائق بعد ذلك.

اشطف الركيزة بماء منزوع الأيونات (DI water) بعد ذلك. قم بالتجفيف الحراري مباشرة على لوح تسخين عند 100 degree Celsius لمدة دقيقة واحدة. قم بنقش الكروم المكشوف عن طريق غمر الركائز لمدة 30 ثانية في كمية كافية من محلول نقش الكروم لتغطيتها بالكامل.

اشطف الركائز بماء منزوع الأيونات (DI water) واغمرها في سائل إزالة Z 300 T بكمية كافية لتغطية الركيزة لمدة 10 دقائق، وذلك لإزالة ما تبقى من المقاوم الضوئي. ثم اشطفها بماء منزوع الأيونات (DI water) وجففها باستخدام غاز النيتروجين.

بعد هذا الترسيب، يتم ترسيب بوليمر عازل من Paraline C بسمك يتراوح بين 2 إلى 5 ميكرومتر على الركيزة عن طريق الترسيب الكيميائي للبخار، ثم يتم ترسيب 50 نانومتر من Teflon AF لجعل السطح كارهًا للماء عن طريق طلاء دوراني لمحلول بتركيز 1% وزن/وزن في flora nerve FC 40 بسرعة 2000 RPM لمدة 60 ثانية على الركيزة.

كرر العملية باستخدام ركيزة زجاجية من أكسيد الإنديوم والقصدير أو ITO غير المعالجة لإنشاء القطب العلوي. قم بخبز كلتا الركيزتين على لوح تسخين عند 160 °C لمدة 10 دقائق لتهيئة جهاز الموائع الدقيقة الرقمي.

قم بإزالة طلاءات البوليمر من منصات التوصيل الخاصة بالركيزة السفلية عن طريق الكشط باستخدام مشرط. قم بتوصيل المنصات المكشوفة للركيزة السفلية بموصلات ذات 40 سنّاً، ثم قم بتشغيل جهاز كمبيوتر يعمل ببرنامج lab view. نحن نستخدم صندوق تحكم مُصنع محلياً يحتوي على مرحلات (relays) يتم التحكم في إشاراتها بواسطة dpad.

يسهل صندوق التحكم بالحاسوب تحكم المستخدم في تطبيق إشارات بقيمة 100 volts RMS لكل 18 kilohertz على الجهاز عبر الموصلات ذات الـ 40 pin. قم أيضاً بتشغيل مولد الدوال والمضخم. قم بتجميع الجهاز عن طريق وضع قطعتين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه بسماكة إجمالية تبلغ 140 micrometer على حواف الركيزة السفلية.

قم بنقل 4 µL من الماء منزوع الأيونات (DI water) باستخدام الماصة إلى أحد الخزانات، ثم أغلق الجهاز بوضع شريحة أكسيد القصدير المطعّم بالإنديوم (indium tin oxide) غير المنقوشة فوق الجهاز بحيث يكون الجانب المطلي بالتفلون موجهاً للأسفل. قم بتوصيل موصل أرضي باللوحة العلوية. قم بتشغيل برنامج التهيئة الذي تم إنشاؤه في مختبرنا باستخدام برنامج lab view لمعايرة التحكم في التغذية الراجعة؛ وبذلك يصبح الجهاز جاهزاً للتجارب.

في هذا البروتوكول، سنستخدم ألبومين المصل البقري أو BSA كعينة بروتينية لاستعراض تصميم واستخدام ميكروفلويديك الرقمي. يتم تخفيف BSA في محلول منظم عامل أو WB يتكون من 100 millimolar tris HCL pH 7.8 مع 0.08%onic F1 27 وزن/حجم. قم بتحضير واحد milliliter من كل عينة ومحلول كاشف، وحدد الخزان الذي سيتم إضافتها إليه.

بعد تحضير الكاشف، قم بإزالة اللوحة العلوية من الجهاز وانقل 4 µL من المحلول إلى الخزان المخصص له باستخدام الماصة. بعد ملء الخزانات، أعد وضع اللوحة العلوية على الجهاز. استخدم برنامج lab view الخاص بالمختبر لتنفيذ الخطوات التالية.

تذكر أن واجهة الكمبيوتر تتيح للمستخدم توزيع قطرات بحجم 600 nanoliter تقريباً من الخزانات والتحكم في هذه القطرات على مصفوفة الأقطاب الكهربائية. أولاً، قم بتوزيع قطرة من عينة تحتوي على بروتين من R one وقطرة من المادة المرسّبة من R two. ادمج القطرتين واترك القطرة المدمجة لتحضن لمدة خمس دقائق حتى تترسب البروتينات على السطح.

قم بنقل الطافي بعيداً عن البروتين المترسب إلى خزان النفايات. وفي الخطوة R three، ولغسل البروتين المترسب، قم بصرف ثلاث قطرات من محلول الغسيل المنظم من R four ومررها فوق البروتين المترسب وصولاً إلى خزان النفايات. اترك الراسب حتى يجف، ثم قم بصرف قطرة من محلول إعادة الإذابة المنظم من R five فوق البروتين.

اترك المحلول المنظم ليتخضن لمدة 20 دقيقة حتى يذوب الراسب. بعد ذلك، قم بتوزيع قطرة من العامل المختزل من R six وادمجهـا مع قطرة العينة. اخلط القطرة المدمجة عن طريق تحريكها عبر ستة أقطاب كهربائية بنمط دائري.

اترك القطرة لتحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوزيع قطرة من عامل الألكلة من R seven ودمجها مع قطرة العينة، ثم قم بالخلط. اترك القطرة لتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء.

أخيراً، قم بتوزيع قطرة من trypsin من الخانة R eight ودمجها مع قطرة العينة، ثم قم بالخلط. اترك القطرة لتتحضن لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة Celsius في طبق Petri على لوح تسخين. ولإيقاف التفاعل، قم بإزالة اللوح العلوي وإخماد عملية الهضم عن طريق السحب بالماصة.

ضع 0.6 milliliters من حمض trichloroacetic بتركيز 2.5% في الماء فوق قطرة التفاعل. قم بتنقية ناتج التفاعل الموقف عن طريق سحب قطرة العينة مباشرة من اللوحة السفلية. باستخدام C 18 zip tip، ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يمكن الآن تخفيف العينات حسب الحاجة وتقييمها بواسطة مطياف الكتلة لتحديد البروتينات الموجودة في العينة باستخدام هذا النظام.

وبعد ذلك، تم تحديد البروتينات بواسطة مطياف الكتلة بدرجات احتمالية أقل من 1 × 10⁻³، وهو ما يعادل فاصل ثقة بنسبة 99.9% وتغطية للتسلسل لا تقل عن 30%. وبناءً على ذلك، تعد تقنية DMF منهجية مفيدة للغاية للمعالجة الآلية لعينات البروتينات. لقد عرضنا اليوم كيفية استخدام الموائع الرقمية الدقيقة لاستخلاص البروتينات ومعالجتها بطريقة آلية. وتوفر هذه المنهجية حلاً محتملاً لمشكلتي فقدان العينات والتلوث أثناء عملية عزل البروتينات وتحديدها.

نأمل في تطبيق هذه الطريقة في المستقبل في تطبيقات بيولوجية أخرى، بما في ذلك المقاييس المناعية والمقاييس القائمة على الخلايا. وعند إجراء هذا النوع من التجارب، فإن أهم شيء هو تذكر الاستمتاع بها. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.