عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفة بروتينية وحداتية لا تتطلب خطوة تنقية، مما يجعلها متوافقة مع أي مكتبة بروتينية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد جينات اصطناعية من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للتجميع (assembly PCR)، ثم يتم توزيع هذه الجينات الاصطناعية في مصفوفة على شرائح الإيبوكسي.

لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة، استخدم PDMS مع قوالب التحكم في السيليكون وقوالب التدفق. ثم يتم محاذاة جهاز الموائع الدقيقة مع مصفوفة DNA المنقطة. وأخيراً، يتم تدفق محلول خلايا الشبكية الحمراء للأرانب (rabbit reticulocyte lysate) داخل جهاز الموائع الدقيقة ليتم التعبير عن البروتينات.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر تعبير الآلاف من البروتينات من خلال الوسم بالأجسام المضادة الفلورية. هناك العديد من المزايا لاستخدام التقنية القائمة على الموائع الدقيقة مقارنة بالطرق الحالية مثل المصفوفات الدقيقة للبروتينات. نقوم بعمل مصفوفات دقيقة للحمض النووي DNA ثم نستخدم الخلايا لإنتاج البروتينات على الجهاز.

وبذلك، لا نحتاج إلى تنقية البروتين ولا تجف البروتينات أبدًا، بل تظل طازجة طوال فترة التجربة. كما توفر تقنية الموائع الدقيقة حساسية أعلى. ولتصنيع جهاز الموائع الدقيقة، يتم تعريض قوالب التحكم والتدفق المصنوعة من السيليكون لبخار chloro trimethyl silene لمدة 10 minutes لتعزيز تحرر الإلاستومر.

بعد خطوات الخبز، قم بتحضير خليط من المطاط المرن القائم على السيليكون وعامل المعالجة بنسبتين مختلفتين؛ خمسة إلى واحد وخمسة وعشرين إلى واحد للقوالب الضابطة وقوالب التدفق على التوالي. صب PDMS بنسبة خمسة إلى واحد فوق الطبقة الضابطة. قم بإزالة الغازات من الطبقة الضابطة واخبزها لمدة 30 دقيقة عند 80 °C.

بعد ذلك، قم بطلاء خليط PDMS بنسبة 20:1 على الطبقة التدفقية باستخدام الطلاء الدوراني بسرعة 2,600 RPM لمدة 60 ثانية، ثم قم بخبزها عند درجة حرارة 80 °C لمدة 30 دقيقة. افصل طبقة التحكم ببطء عن القالب، مع الحرص على عدم تقشير نمط SU eight. ثم باستخدام المشرط، قم بقص الجهاز حول محيطه، واستخدم إبرة غير حادة لثقب فتحات للوصول إلى قنوات التحكم تحت المجهر.

قم بمحاذاة طبقتي التدفق والتحكم يدويًا، بدءًا من الزاوية العلوية اليسرى مع وضع صمام الزر الموجود في طبقة التحكم في منتصف غرفة التفاعل. بعد ذلك، قم بمحاذاة الصف الأول ثم حرر طبقة التحكم برفق صفًا تلو الآخر. تأكد من أن جميع صمامات الأزرار تقع في منتصف غرف التفاعل، وأن صمامات العناوين والمدخلات تتقاطع مع قنوات التدفق في الموضع الصحيح.

كرر العملية محلياً حتى يتم محاذاة جميع الصفوف. عند اكتمال المحاذاة، قم بتحرير أي شد في الـ PDMS عن طريق رفعه بعناية من الجوانب والزوايا. ثم قم بخبز الجهاز لمدة ساعتين عند 80 °C بعد الخبز.

قم بالقص حول المحيط وانزع الجهاز المكون من طبقتين من ثقوب لكمة قالب التدفق للوصول إلى قنوات التدفق من أجل توليد بنيات DNA للجهاز. قم بإجراء تفاعل PCR لإنتاج جينات اصطناعية تتكون من محفز T7، وموقع ارتباط الريبوسوم، وإطار قراءة مفتوح مع علامات إيبيتوب مختلفة عند كلا الطرفين، ومُنهي T7. ولتحضير الجينات الاصطناعية لعملية المصفوفة، قم بإعداد خليط من البولي إيثيلين جلايكول و D triose dihydrate. قم بتوزيع 2 µL لكل تفاعل في آبار طبق 384.

لوحة الآبار. أضف الجينات الاصطناعية إلى لوحة ذات 384 بئراً. ثم أضف الماء المقطر للوصول إلى حجم نهائي قدره 20 µL.

بعد ذلك، باستخدام بقعة مصفوفة مجهرية، يتم وضع سلسلة من الجينات الاصطناعية على ركائز زجاجية مطلية بالإيبوكسي. وباستخدام المجهر الستيريوسكوبي، قم بمحاذاة الجهاز الموائع الدقيقة يدويًا مع مصفوفة الجينات، بحيث تكون بقعة الـ DNA متمركزة في منتصف غرف الـ DNA. ثم قم بمحاذاة بقية الصفوف.

والختام بضبط الجهاز بالكامل بدقة للتخفيف من أي إجهاد على الـ PDMS وضمان ارتباطه جيداً بالمصفوفة الدقيقة. ارفعه موضعياً. وأخيراً، قم بربط الجهاز بالشريحة الزجاجية عن طريق تحضينه طوال الليل على لوح ساخن عند 80 °C.

تُستخدم صبغات الطعام في هذا القسم لأغراض التصوير المرئي. يتم تشغيل الصمامات الموجودة في طبقة التحكم بواسطة الكمبيوتر باستخدام برنامج lab view. ويتحكم نص lab view البرمجي في سلسلة من الصمامات الدقيقة ذات الملف اللولبي (solenoid) عبر صندوق تحكم إلكتروني.

يتم توصيل مجمّع الصمامات الملفية بالهواء المضغوط، والذي يتحكم في تدفق الهواء وضغطه داخل صمامات التحكم في الجهاز. وباستخدام أنبوب بلاستيكي مرن بقطر داخلي يبلغ 0.02 inches ودبوس من الفولاذ المقاوم للصدأ، قم بتوصيل الجهاز بمجمّع الصمامات الملفية. املأ الأنابيب بالماء المقطر مرتين ثم أدخل الدبوس في فتحات الوصول الخاصة بطبقة التحكم.

تأكد من توصيل كل أنبوب بقناة التحكم المقابلة له. ولتنشيط قنوات التحكم، قم بتشغيل تطبيق LabVIEW، واضبط ضغط الهواء على 5 PSI، ثم طبق ضغط الهواء عن طريق تفعيل الصمام من برمجية LabVIEW. سيؤدي ذلك إلى دفع الماء داخل قنوات التحكم المصنوعة من PDMS لتحديد أي تداخل محتمل بين قنوات التحكم في الأجهزة المعيبة.

املأ صمامات الساندويتش (sandwich) والعنوان أولاً. وبعد امتلاء جميع قنوات وصمامات التحكم بالماء، قم بتهيأة الصمامات لإغلاق قنوات التدفق الموجودة أسفلها. يتم ذلك أولاً بزيادة ضغط الهواء إلى 15 PSI، ثم من خلال برنامج LabVIEW عبر مجموعة من مفاتيح التشغيل والإيقاف المتصلة بصمامات ملف لولبي (solenoid valves) فردية.

قم بتنشيط جميع الصمامات عن طريق تشغيل جميع أزرار المفاتيح للتأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة. صِل أنبوبًا بأحد مداخل التدفق، وقم بتدفق الهواء في الجهاز بضغط 4 إلى 5 PSI. سيؤدي ذلك إلى تحرير أي صمامات عالقة من الشريحة الزجاجية.

الجهاز الآن مجهز وجاهز لأغراض التصوير المرئي. يُستخدم صبغ طعام أصفر لتصوير الكواشف في هذا القسم، ويمثل المحلول عديم اللون الـ hippies لتسهيل التجميع الذاتي لمصفوفة البروتين على السطح ومنع الامتصاص غير النوعي داخل الجهاز الموائع الدقيقة؛ لتعديل السطح كيميائياً، ابدأ بتوصيل أنبوب جديد يحتوي على المحلول المطلوب بأحد قنوات التدفق في الجهاز. ثم قم بتوصيل الطرف الحر من الأنبوب بالمشعب اليدوي وافتح تدفق ضغط الهواء.

ضع 40 µL من BSA المرتبط بالبيوتين في أنبوب جديد، ومرر ما يقرب من نصف هذه الكمية عبر الجهاز لمدة 20 دقيقة. استخدم 50 mM من hippies لغسل أي ركيزة غير متفاعلة بين كل خطوة من الخطوات. بعد ذلك، مرر 25 µL من الستريبتاديفين لمدة 20 دقيقة.

بعد إضافة BSA المبيوتني، اغسل باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لترطيب السطح المحيط بالزر، ثم أغلق صمام الزر ومرر بقية الـ BSA المبيوتني، وبعد ذلك اغسل باستخدام PBS مرة أخرى لمدة خمس دقائق. أخيراً، لإنشاء مصفوفة مضادة لـ hiss tag أسفل الزر، افتح صمام الزر ومرر 30 µL من Penta hiss biotin لمدة 20 دقيقة لإنشاء مصفوفة من البروتينات على الجهاز. افتح صمامات الرقبة ومرر rabbit reticulocyte.

قم بإضافة محلول تفاعل النسخ والترجمة المقترن السريع من خلال الجهاز إلى غرفة DNA. بعد ذلك، أغلق صمامات الساندوتش لعزل كل جين عن بيئته، وحضن الجهاز على لوح تسخين لمدة 2.5 hours عند 30 °C. ثم قم بتمييز الطرف النهائي للبروتينات باستخدام C mix SI three antibody.

أخيراً، وباستخدام ماسح مصفوفة دقيقة مزود بليزر بطول موجي 532 nanometer ومرشح انبعاث بطول موجي 575 nanometer، يتم تحديد مستويات البروتين. يوضح هذا الشكل المستويات المتفاوتة للتعبير البروتيني على مصفوفة بروتينية.

عادةً ما يفشل 20% من مكتبة الجينات في التعبير عن نفسها بمستويات يمكن الكشف عنها. وقد تم تحديد مستويات الخلفية باستخدام حجرات لم يتم وضع الحمض النووي DNA فيها. وبناءً على ذلك، فإن الإشارات الصادرة من حجرات البروتين المقابلة تعود إما إلى الضوضاء أو إلى الامتصاص غير النوعي للأجسام المضادة الواسمة.

إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح، فإن عملية التحقق من الجهاز تستغرق أربع ساعات، بينما تستغرق تجربة الشريحة خمس ساعات.