سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

لرسم خرائط مواقع ارتباط البروتينات النووية الريبوزية على جزيئات pre mRNAs، ابدأ بتغطية المنطقة المحددة من prem NNA المستهدفة بنوافذ تبلغ 30 nucleotide، ثم قم بتصنيع هذه القسيمات قليلة النوكليوتيد (oligos) الموزعة على مصفوفة. يتم فصل الـ oligos عن المصفوفة عن طريق الغليان، ثم تُرسب مع RNP المستهدفة. يتم وسم المجمع الابتدائي الكلي بـ SCI three، بينما يُوسم المجمع المرتبط بـ SCI five، ثم يُطبق كلاهما على مصفوفة الكشف.

يتم بعد ذلك فحص المصفوفة واستخدام برنامج استخراج الميزات لتفسير النتائج. الأملاح. مرحباً، أنا كيت واتكينز من مختبر ويل فيربراذر في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية (MCB) بجامعة براون. سأعرض لكم اليوم إجراءً سريعاً وغير مكلف لتحديد الموقع الدقيق لمعقد البروتين RNA على prem RA في المختبر، حيث يتم تخليق prem A كمجموعة من قليلات النوكليوتيد المتداخلة.

يمكن بعد ذلك فصل هذا المزيج إلى جزء مرتبط وجزء غير مرتبط عن طريق الترسيب المناعي المشترك، ثم تحليلها باستخدام المصفوفات الدقيقة. وبينما يتمتع هذا الإجراء بتطبيقات عديدة، فإننا نستخدمه لدراسة عوامل ربط متعددة ودورها في الربط البديل. لذا، لنبدأ الآن.

لبدء هذا الإجراء، استخدم متصفح جينوم uc SC لتنزيل جينات معينة، أو وصلات ربط، أو مناطق أخرى ذات أهمية لتصميم تجمع prem A. حدد النوافذ ذات الأهمية، ثم قم بترتيبها حسابياً بطول قراءة يبلغ 30 nucleotide وتداخل يبلغ 20 nucleotide بحيث يتم إزاحة كل oligo بمقدار 10 nucleotides عن الذي يسبقه. والآن بعد تحديد الـ oligos بطول 30 nucleotide، قم بإحاطة كل منها بتسلسلات بادئة عالمية.

أرسل قليلات النوكليوتيد (oligos) إلى شركة Agilent لطباعتها على مصفوفة دقيقة مخصصة من قليلات النوكليوتيد. بمجرد وصول المصفوفة الدقيقة، ابدأ في استعادة قليلات النوكليوتيد DNA من سطحها عن طريق وضع شريحة غطاء المصفوفة في غرفة تهجين المصفوفة، ثم سحب 500 microliters من الماء منزوع الأيونات برفق باستخدام الماصة ووضعها على الشريحة. ضع شريحة المصفوفة الدقيقة ووجهها للأسفل فوق شريحة الغطاء بحيث تتقابل الملصقات الموجودة على كل شريحة، واحرص على تجنب تكون فقاعات الهواء التي قد تعيق عملية استعادة قليلات النوكليوتيد.

أغلق غرفة التهجين وقم بتدويرها طوال الليل عند 99 درجة Celsius في فرن تهجين. وفي اليوم التالي، أخرج المصفوفة بعناية من الغرفة واسحب الماء، الذي يحتوي الآن على قليلات النوكليوتيد (oligos) المتحررة من سطح المصفوفة. ضع تجمع قليلات النوكليوتيد المتحررة في أنبوب إبندورف سعة 1.5 milliliter وقم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتفكيك التكتلات المحتملة عند سعة 50% ثلاث مرات، على شكل نبضات مدتها من ثلاث إلى خمس ثوانٍ في كل مرة. بعد ذلك، قم بتضخيم التجمع عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) منخفض الدورات باستخدام بادئات عالمية مضاف إلى نهايتها محفز T.

قد يختلف عدد الدورات المطلوبة اعتماداً على كفاءة استعادة الأوليغونوكليوتيدات. تجنب الإفراط في التضخيم، والذي يظهر على شكل حزمة ملطخة في هلام الأكريلاميد. وأخيراً، استخدم مجموعة mega short script من شركة Amon لنسخ الـ RNA.

أنهِ تفاعل النسخ باستخلاص الـ RNA باستخدام الفينيل كلوروفورم، يليه الترسيب بالإيثانول باستخدام خلات الصوديوم مع استخدام glyco blue كحامل. أعد تعليق كتلة الـ RNA في 105 µL من منظم TE. وذلك لتحديد تركيز الـ RNA بدقة.

استخدم ribo green لإنشاء منحنى قياسي. ثم قم بالقياس باستخدام قارئ لوحات الفلورسنت. أصبح تجمع RNA الآن جاهزاً لبدء عملية الترسيب المناعي المشترك لسحب البروتينات.

أولاً، قم بتحضير الخرزات المغناطيسية عن طريق دمج خرزات dyna من البروتين A والبروتين G بنسبة واحد إلى واحد ليصل الحجم النهائي إلى 50 microliters لكل تفاعل. قم بتركيز الخرزات في مكان واحد باستخدام حامل فصل مغناطيسي من أجل إزالة السائل الطافي. ثم اغسلها مرتين بحجم مساوٍ من محلول 1X PBS البارد بعد الغسلة الثانية.

أعد تعليق الخرزات في حجم مساوٍ من محلول 1x PBS البارد وأضف 2 ng من الجسم المضاد. قد تختلف هذه الكمية حسب نوع الجسم المضاد، لذا قد يلزم إجراء تجارب لتحديد الظروف المثلى لربط الجسم المضاد بالخرزات. حضّن الخليط طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على منصة دوارة.

في الصباح، أضف 2 µg من إجمالي RNA للخميرة المعالج بالموجات فوق الصوتية لكل تفاعل لمنع الارتباط غير النوعي، ثم قم بالتدوير لمدة 30 دقيقة إضافية عند 4 °C. وبمجرد انتهاء خطوة المنع، استخدم الحامل المغناطيسي مرة أخرى لإزالة السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الخرز مرتين باستخدام 1X PBS بارد، مع ترك PBS من الغسلة الثانية في الأنبوب، ثم وزع 50 µL من خليط الخرز في أنابيب جديدة.

أنبوب واحد لكل تفاعل co IP. أصبحت الحبيبات الآن جاهزة لعملية co ip. بعد ذلك، قم بتحضير الخليط الرئيسي عن طريق دمج مجموعة RNA oligo مع مستخلص الخلايا النووية.

كـمصدر لـ RNP، خذ حجمًا قدره 50 µL من المزيج الرئيسي كعينة حماية إجمالية. يمكن إضافة البادئات (Primers)، وهي نسخ RNA من البادئات العامة، لمنع ارتباط البروتين بتسلسل البادئ أو منع تكوّن بنية ثانوية في RNA. لبدء عملية الترسيب المناعي المشترك (co immunoprecipitation)، قم بإزالة السائل الطافي من حصص الخرز وأعد تعليق الخرز في 120 µL من المزيج الرئيسي المتبقي. قم برج التفاعلات عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين.

في نهاية فترة التحضين، يمكن إزالة كمية صغيرة من Eloqua، بما في ذلك الخرزات، من كل co ip. ولإجراء اختبارات إضافية لكفاءة الارتباط أو النوعية، توضع بقية التفاعلات على المغناطيس ويتم إزالة المادة الطافية، يلي ذلك غسلها مرة إلى مرتين باستخدام cold one XPDS.

إن الحمض النووي الريبوزي (RNA) المرتبط بالأجسام المضادة الموجودة على الخرزات عبر البروتين النووي الريبوزي (RNP) هو عينة الترسيب المناعي (IP). أعد تعليق خرزات الترسيب المناعي في 50 µL من محلول 1% SDS في منظم XTE بتركيز 0.1X، ثم قم بتسخين العينات عند 65 °C لمدة 15 دقيقة. ولشطف الـ RNA، قم بإزالة الراشح، الذي يحتوي الآن على الـ RNA الذي كان مرتبطاً سابقاً بالخرزات، وقم بتنقيته عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم، يليه الترسيب بالإيثانول، ثم أعد تعليق الراسب في 50 µL من منظم XT بتركيز 0.1X.

بعد ذلك، قم بإجراء النسخ العكسي للعينات باستخدام البادئات العامة العكسية. ثم قم بتضخيم العينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام البادئات العامة، والتي يجب أن يحتوي أحدها على محفز T7. سيعتمد عدد الدورات المطلوبة لتضخيم المزيج على كفاءة عملية الترسيب المناعي المشترك (co ip).

باستخدام طقم MegaShorts script من شركة Ambion، قم بنسخ العينات مرة أخرى، ولكن أضف هذه المرة 2 µL من amino allyl UTP بدلاً من T7 UTP المرفق مع الطقم. سيتم استخدام amino allyl UTP لاحقاً لوسم الـ RNA باستخدام side eyes. عند اكتمال عملية النسخ.

يتم استخلاص العينات باستخدام الكلوروفورم الفينيلي وترسيبها باستخدام الإيثانول. تجنب استخدام glyco blue أو خلات الأمونيوم، حيث قد يتداخلان مع تهجين العينات على المصفوفة. أعد تعليق الراسب في 4.5 µL من كربونات الصوديوم بتركيز 0.1 M.

لتسمية العينات أولاً، أضف 2.5 µL من الماء الخالي من النيوكلييز إلى العينة الكلية. أضف 3 µL من S3 وإلى عينة الـ IP أضف 3 µL من SCI five. احضن العينات في الظلام لمدة ساعة واحدة.

عند درجة حرارة الغرفة، قم بإيقاف التفاعل بإضافة 6 µL من هيدروكلوريد الهيدروكسيلامين بتركيز 4 M إلى كل عينة، ثم اخلطها جيداً وقم بالطرد المركزي. حضّن العينات لفترة وجيزة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتنقية العينات الموسومة عن طريق الاستخلاص بالفينيل كلوروفورم، يليه الترسيب بالإيثانول. يتم سحب معظم اللون إلى الطور العضوي مع النيوكليوتيدات الحرة، لذا قد لا تظهر الكريات المترسبة ملونة بشكل مرئي.

أعد تعليق كل راسب في 50 µL من 0.1 XTE. اتبع تعليمات مجموعة تهجين المصفوفات من Agilent لتحضير عينة المصفوفة الدقيقة مع الاستثناء التالي: لا تقم بتجزئة الـ RNA؛ فبعد إضافة محلول التجزئة، أضف فوراً محلول التهجين لإيقاف عملية التجزئة.

ضع العينات على المصفوفة وقم بإجراء التهجين عند 50 °C لمدة ثلاث ساعات مع تدوير المصفوفة. قم بتحضير المحاليل التالية بحجم 50 mL في أنابيب مخروطية سعة 50 mL: أنبوب واحد من SC buffer بتركيز 2×، وأنبوبان من SC buffer بتركيز 1×، وأنبوب واحد من الماء منزوع الأيونات.

بعد فترة الحضانة التي استمرت ثلاث ساعات، قم بفك مشابك شريحة المصفوفة بعناية وضعها في محلول 2XSSC المنظم. وباستخدام ملقط، افصل المصفوفة برفق عن شريحة الغطاء.

قم بإزالة شريحة الغطاء برفق، مع الحرص على عدم لمس المصفوفة. وأثناء سحب الشريحة، أغلق الأنبوب المخروطي واقلبه برفق لمدة 60 ثانية. باستخدام الملاقط، انقل المصفوفة إلى محلول one XSSC.

أغلق الأنبوب بالغطاء واقلبه بلطف لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المصفوفة إلى محلول XSSC الثاني، واقلبه مجدداً بلطف لمدة دقيقة أخرى. وأخيراً، انقل المصفوفة إلى أنبوب يحتوي على ماء منزوع الأيونات واقلبه بلطف لمدة 30 ثانية.

جفف المصفوفة عن طريق وضع حواف الشريحة على منديل "kim wipe". استمر في تدوير المصفوفة على المنديل، مع الحرص على عدم المساس بالجانب الذي يحتوي على الـ oligos. ضع المصفوفة في أنبوب مخروطي فارغ ثم ابدأ في مسح المصفوفة ضوئياً.

باشر بمسح المصفوفة. إليكم مصفوفة نموذجية؛ حيث يظهر كل ملمح أو أوليغو إما باللون الأخضر لمجموعة التجميع الكلية غير المخصبة، أو باللون الأحمر لمجموعة التجميع المخصبة عن طريق الترسيب المناعي (IP).

يتم تطبيع الإشارة عند كل سمة نسبةً إلى الكثافة الإجمالية في تلك القناة. والمخرج النهائي هو النسبة اللوغاريتمية للقناة الحمراء مقابل القناة الخضراء. وعند كل سمة في المصفوفة، يتم تعيين متوسط الدرجة عند كل إحداثي جينومي إلى الموقع المحدد.

يُقدم توضيح لخطوة المتوسط هذه لثلاثة قليلات نوكليوتيد (oligos) متداخلة بطول 30 نوكليوتيد وبدرجات تبلغ 2 و4 و0.5، حيث يتم عرض متوسط درجة الإثراء لكل نافذة مكونة من 10 نوكليوتيد. وفيما يلي مثال على مخطط ارتباط لبروتين الربط متعدد البيرين PTB عند جين CLTA؛ حيث تظهر سمات الجين على طول الجزء السفلي، وتمثل الأشرطة الرأسية ذات اللون الأحمر الداكن لوغاريتم متوسط درجات الإثراء لـ PTP المرتبطة. وتوضح الأشرطة ذات اللون الأحمر الفاتح المناطق غير المثراة لارتباط PTP.

لقد أوضحتُ لكم للتو كيفية إنشاء تجمع من قليلات النيوكليوتيد (oligonucleotide pool) بسرعة وكفاءة بحيث يغطي مناطق الاهتمام، مثل الأكسونات ذات الوصل البديل. نقوم بتحليل التجمعات لدينا باستخدام المصفوفات الدقيقة (microarray)، ولكن من الممكن أيضاً تسلسلها إما عن طريق تسلسل illuminous، أو تسلسل Lexi، أو تسلسل Sanger التقليدي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن عملية إنشاء التجمع قابلة للتعديل إما على مستوى RNA أو على مستوى البروتين.

على مستوى الـ RNA، يمكننا إدخال مناطق ذاتية المنشأ، أو طفرات مرضية، أو تعدد أشكال، أو طفرات عشوائية في تسلسل قليلة النوكليوتيد. أما على مستوى البروتين، فيمكن تعديل عامل ربط الـ RNA عن طريق الفسفرة أو تعديلات أخرى ما بعد الترجمة. كما يمكن التحكم في بيئة الربط إما لزيادة أو تقليل مستويات العوامل الإضافية التي تتنافس مع بروتين ربط الـ RNA المستهدف أو تتفاعل معه.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.