طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

الهدف من هذا الفيديو هو توضيح طريقة عزل وتحديد مكونات الـ RNAs والبروتينات الخاصة بمركبات البروتين النووي الريبوزي من مستخلصات خلوية باستخدام طرق الترسيب المناعي. مرحباً، اسمي Garrett Dom وأنا طالب دراسات عليا في قسم الجزيئيات والميكروبيولوجيا والمناعة بجامعة Missouri، وأقوم بدراستي تحت إشراف الدكتور Eli sso. فمن خلال التقدم في تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية وتحليل المصفوفات الدقيقة الفعال، أصبح التعبير الجيني العالمي وتحليله شكلاً سهلاً ومتاحاً لجمع البيانات في العديد من نماذج الأبحاث والأمراض.

ومع ذلك، فإن دراسة مستويات الحالة المستقرة لـ mRNA للجين المستهدف لا ترتبط دائمًا بشكل مباشر بمستويات البروتين في الحالة المستقرة. ويُعد التنظيم الجيني بعد النسخي تفسيرًا مرجحًا لهذا التباين بين الاثنين، والذي تحركه تفاعلات البروتينات المرتبطة بـ RNA.

تؤثر التنظيمات ما بعد النسخ على تموضع الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) واستقراره وترجمته من خلال تكوين معقد بروتيني نووي ريبوزي مع جزيئات mRNA المستهدفة. ويعد تحديد هذه الأهداف المجهولة من mRNA المستحدثة (Denovo) من المستخلصات الخلوية في هذا المعقد أمراً محورياً لفهم آليات ووظائف البروتين الرابط للحمض النووي الريبوزي (RNA binding protein) وتأثيرها الناتج على إنتاج البروتين. يوضح هذا البروتوكول طريقة تسمى الترسيب المناعي للمعقد البروتيني الريبوزي، أو RIP، والتي تسمح بتحديد جزيئات mRNA محددة مرتبطة في المعقد البروتيني النووي الريبوزي.

قبل البدء في التجربة، من الضروري توفير جميع الكواشف والحاويات والأدوات. يجب معالجة الأدوات الزجاجية بمثبط RNase لضمان خلوها من الـ RNA، مثل RNA ZAP من شركة Ambion، ثم شطفها بماء معالج بـ dpci، والتأكد من أن جميع الكواشف مؤكدة خلوها من الـ RNA. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في استخلاص معقد البروتين النووي الريبوزي من المستخلص الخلوي؛ حيث يتم جمع خلايا أنسجة في طور النمو الأسي لإنتاج ما بين 2 إلى 5 mg من البروتين الكلي لكل عينة مستخدمة، وعادةً ما تكون أطباق زراعة P150 عدد اثنين كافية.

نقوم هنا بحصاد خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية MB 2 31 وMC seven، وبحث التفاعلات الريبونوكليوزية لبروتين ربط الحمض النووي الريبي. ومن المهم ملاحظة أنه بالنسبة لكل بروتين ربط RNA يتم استقصاؤه، يجب تحسين العدد الكلي للخلايا وكميات البروتين لزيادة التفاعلات المناسبة بين mRNA المستهدف وبروتين ربط RNA إلى الحد الأقصى. يتم تجميع الخلايا عبر الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة تتراوح تقريبًا من 8 إلى 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم تُغسل ثلاث مرات باستخدام PBS بارد جداً. بعد الغسلة النهائية، يتم نقر قاع الأنبوب برفق وإعادة تعليق كتل الخلايا في أحجام متساوية من منظم تحليل البوليسومات المُحضّر والمحتوي على مثبطات RNases والبروتياز.

يُنصح بقياس الحجم الدقيق لراسب الخلايا، ثم سحب الخليط بلطف باستخدام الماصة لتفكيك تكتلات الخلايا، وتحضين المُحلل على الثلج لمدة خمس دقائق. يتم إجراء الطرد المركزي عند 13,000 G لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C لتخليص المُحلل من الحطام، ثم يُنقل السائل الطافي المصفى فوراً إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة مسبقاً ومخصصة لـ RNAs، وتُحفظ على الثلج ثم تُخزن عند درجة حرارة -80 °C.

يمكن تخزين هذه المادة المستخلصة لمدة تصل إلى ستة أشهر عند درجة حرارة -80 °C. تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة لأن ذلك قد يؤدي إلى تحلل البروتين و/أو mRNA. ومن الأفضل إجراء عملية الترسيب المناعي (IP) فوراً.

قم بإجراء تقدير كمي سريع لتركيز البروتين في المستخلص باستخدام مقايسة برادفورد القياسية للبروتينات. بعد ذلك، سنحتاج إلى تحضير المواد اللازمة لعزل البروتين المحدد المستهدف. أولاً، قم بنقع البروتين مسبقاً لزيادة حجمه.

يتم نقع خرزات Sphero طوال الليل في محلول NT two buffer المضاف إليه 5% BSA وتُحفظ عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. يُستخدم محلول NT two buffer بنسبة أربعة إلى واحد مع خرزات PAS. يمكن تخزينها لفترات طويلة تصل إلى عدة أشهر عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

عند التدعيم بـ 0.1% sodium azi قبل الاستخدام، يتم إزالة الفائض من NT two buffer بحيث تكون النسبة النهائية للخرز إلى المنظم واحد إلى واحد. باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من RNA سعة 1.5 milliliter، يتم سحب 100 microliters من SRO speed slurry وإضافة 30 micrograms من الأجسام المضادة لكل تفاعل IP فردي. على سبيل المثال، استخدمنا في تجربتنا جسماً مضاداً لـ who are، وهو عبارة عن جسم مضاد من نوع mouse IgG one.

وبناءً على ذلك، فإن الأجسام المضادة الضابطة لدينا هي أيضاً من نوع IgG. بعد ذلك، أضف 100 إلى 200 µL من المنظم NT two إلى خليط الخرزات والأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يجب استخدام جسم مضاد مطابق للنمط الإسوي أو مصل طبيعي كامل من نفس الفصيلة بالتوازي كضابط للأجسام المضادة للكشف عن حمض RNA الخلفي.

أضف الجسم المضاد المناسب إلى خليط الخرز واتركه لليلة كاملة مع التقليب المستمر (tumbling) في جهاز دوّار عند درجة حرارة 4 °C. قم بتحضير الخرز المغلف بالأجسام المضادة مباشرة قبل الاستخدام عن طريق الغسل بـ 1 mL من منظم NT2 المبرد بالثلج خمس مرات، واغسل الخرز بواسطة الطرد المركزي عند 13,000 G لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند درجة حرارة 4 °C. أزل السائل الطافي بعناية باستخدام ماصة يدوية أو جهاز شفط.

تساعد عملية الغسل هذه في إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وكذلك ملوثات الـ RNAs من خليط الأجسام المضادة. وبمجرد اكتمال الغسلة النهائية، يتم إعادة تعليق الحبيبات في 700 microliters من منظم T two البارد جداً، يليه المعالجة بمثبطات RNAs متنوعة لحماية الـ mRNAs المستهدفة، بما في ذلك 10 microliters من RNAs، و10 microliters من 100 millimolar DTT و 15 microliters من EDTA. يتم إكمال الحجم إلى 900 microliters باستخدام منظم NT two.

بعد ذلك، سنقوم بترسيب المناعي للمعقد المستهدف. نوصي بشدة باستخدام خطوة التطهير المسبق (pre-clear) لتقليل إشارة الخلفية في تحليل RNA بعد إجراء عملية الـ rip؛ قم بالتطهير المسبق باستخدام 15 micrograms من التحكم المتماثل النوع (isotype control) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. أضف 50 microliters من حبيبات PAS المنتفخة مسبقاً وغير المطلية بالأجسام المضادة.

حضن العينة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير، ثم يتم الطرد المركزي عند 10,000 G عند درجة حرارة 4 °C. يتم ترسيب العينة. احفظ السائل الطافي لاستخدامه في عملية الترسيب المناعي (ip).

بعد ذلك، أضف 100 µL من المستخلص الخلوي المصفى والمعزول الذي يحتوي على ما يقرب من 2 إلى 5 mg من البروتين إلى مزيج الأجسام المضادة المُجهَّز. سيساعد تخفيف المستخلص الخلوي في تقليل الخلفية، أغلق الأنبوب جيداً باستخدام غطاء البارافيلم لضمان الإحكام، ثم حضّن المزيج عند 4 °C لمدة أربع ساعات مع التقليب المستمر، وفي الخطوة التالية، قم بترسيب الخرز عند 5,000 G لمدة خمس دقائق عند 4 °C واحفظ السائل الطافي للتحليلات المحتملة عن طريق تخزينه عند 80- °C كما تم وصفه سابقاً. اغسل الخرز خمس مرات باستخدام 1 mL من منظم TNT 2 البارد جداً مع إجراء عملية الطرد المركزي.

ثم قم بإزالة الطافي باستخدامماصة يدوية أو جهاز شفط. يمكن استخدام طرق أكثر صرامة لتقليل الخلفية عن طريق تدعيم المنظم NT two بـ sodium deoxy coate أو اليوريا أو SDS. حافظ على العينات فوق الثلج قدر الإمكان واعمل بسرعة لتقليل تحلل mRNA المستهدف.

أخيراً، سنستخدم معالجات DNAs والبروتينيز K، متبوعة بترسيب RNA لعزل RNAs الخاصة بالبروتينات النووية الريبوزومية؛ فبعد الغسل، أعد تعليق الحبيبات في 100 µL من منظم N NT two المضاف إليه 5 µL من DNAs one الخالي من RNAs. احتفظ بالعينات عند 37 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. أضف 1 mL من منظم N NT two وقم بالطرد المركزي عند 5,000 G لمدة خمس دقائق.

تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق حبيبات SROs في 100 µL من منظم NT2 مع إضافة 5 µL من proteinase K بتركيز 10 mg/mL و1 µL من SDS بتركيز 10%. قم بحضن خليط الحبيبات المعاد تعليقها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 55 °C، مع النقر الخفيف كل 10 دقائق. سيساعد proteinase K في تحرير مكونات البروتين النووي الريبوزي. قم بترسيب الحبيبات.

قم بالطرد المركزي بسرعة 5,000 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اجمع السائل الطافي، والذي يجب أن يكون حجمه حوالي 100 µl تقريبًا. بعد ذلك، أضف 200 µl من محلول NT 2 المنظم إلى الكريات، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 5,000 G لمدة دقيقتين. اجمع ما يقرب من 200 µl من السائل الطافي وتخلص من الكريات.

امزج السائل الطافي وأضف 300 µL من حمض الفينول للطبقة السفلية، ثم استخدم جهاز الرج (vortex) لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وقم بالطرد المركزي بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. اجمع 250 µL من الطبقة العليا.

يجب الحرص الشديد على عدم تحريك الواجهة البينية لتجنب التلوث. أضف إلى عينة RNA مقدار 25 µL من أسيتات الصوديوم عند pH 5.2 و 625 µL من الإيثانول المبرد بتركيز 100% و 5 µL من مزيج glyco blue. اخلط المكونات جيدًا ثم تُحفظ العينة طوال الليل عند درجة حرارة -20 °C.

بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استعادة الـ RNA بشكل صحيح، فإن إضافة الـ glyco blue ستزيد من وضوح كتلة الـ RNA من خلال عملها كجزيء حامل؛ في اليوم التالي، امزج الأنابيب عن طريق قلبها من ثلاث إلى خمس مرات، ثم قم بالطرد المركزي عند 12,000 G في درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة وتخلص من السائل الطافي. أضف 1 mL من الإيثانول المبرد بتركيز 70% إلى الكتلة الزرقاء وامزجها عن طريق القلب أو باستخدام جهاز الـ vortex ثم قم بالطرد المركزي.

قم بطرد العينة مركزياً بقوة 12,000 G عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. تخلص من السائل الطافي ثم قم بالطرد المركزي بقوة 12,000 G لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. أزل أي بقايا من الإيثانول 70% باستخدام الماصة وجفف الراسب بالهواء.

اترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أعد التعليق في 20 إلى 40 µL من مياه خالية من RNAs وDNA. العينة الآن جاهزة للتقدير الكمي باستخدام مقياس الطيف NanoDrop والتطبيقات اللاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR) أو تحليل المصفوفات الدقيقة (microarray analysis). بعد عزل RNA، تم إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للكشف عن أهداف mRNA للبروتين الرابط لـ RNA الذي تم تحديده، ومدى الإثراء الناتج عن الترسيب المناعي.

يكشف التأكيد بواسطة لطخة وسترن (western blot) عن عزل نقي لبروتين who are. ويُظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Quantitative PCR) مقدار إثراء mRNA المستهدف beta actin مقارنة بضوابط IgG one. وبينما يكشف تحليل المصفوفات الدقيقة (microarray) عن ملفات تعريف جينية فريدة بين خطوط خلايا سرطان الثدي MC seven و MB 2 31، فقد أثبتت مجموعتنا، بالإضافة إلى العديد من المجموعات البحثية الأخرى، أن الترسيب المناعي للبروتينات النووية الريبوزية (rib nucleo protein immunoprecipitation) أداة ممتازة تُستخدم لعزل ودراسة التفاعلات بين البروتينات المرتبطة بـ RNA وأهداف MR.A الخاصة بها؛ ورغم طبيعة هذا الإجراء وممارسته الحساسة، فإن التنفيذ السليم له سيؤدي إلى عزل هذه المعقدات البروتينية النووية الريبوزية، والتي كانت حتى وقت قريب غير متاحة للاكتشاف والتحليل.