صامت Presynaptically الوصلات العصبية درس مع المجهر الضوئي

تبدو بعض النهايات قبل المشبكية في الجهاز العصبي المركزي غير وظيفية أو صامتة. نقدم هنا بروتوكولاً لتحديد النهايات قبل المشبكية الصامتة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحديد العلاجات والتدخلات التي يُشتبه في أنها تؤدي إلى إسكات النهايات أو إيقاظها.

يجمع هذا البروتوكول بين وسم الحويصلات التشابكية باستخدام صبغة حيوية أثناء إزالة الاستقطاب العصبي، ووسم الخلايا المثبتة لاحقاً باستخدام جسم مضاد يحدد جميع النهايات قبل التشابكية، سواء كانت صامتة أو نشطة. وتعتبر التشابكات التي تم وسمها بالصبغة والجسم المضاد معاً نشطة، بينما تعتبر التشابكات التي وسمها الجسم المضاد فقط صامتة.

مرحباً، أنا أماندا تايلور من مختبر الدكتور ستيف مينيك في قسم الطب النفسي بكلية الطب بجامعة واشنطن. وأنا شاهين أيضاً من مختبر Manic. نود اليوم أن نعرض لكم إجراءً لتصوير النهايات قبل التشابكية الصامتة باستخدام عصبونات الحصين المستزرعة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية قيام النشاط الكهربائي ومسارات الإشارات الفردية الأخرى بتعديل إفراز الناقلات العصبية. لذا، لنبدأ العمل. في غطاء تدفق صفائحي معقم، استخدم ملقط HIPA لجمع عينات من جرذان أو فئران في الفترة من اليوم صفر إلى الثالث بعد الولادة لتحضير مستنبتات خلوية مفككة.

وفقاً للبروتوكول المنشور الخاص بنا، فإن المزارع المستخدمة هي مزارع دبقية مختلطة مشتقة من نفس عملية التشريح، ويجب زرع الخلايا في أطباق معقمة بقطر 35 مليمتر. يحتوي كل طبق على شريحة غطاء رقم صفر مغطاة بـ 5 mg/mL من الكولاجين. تُزرع العصبونات بكثافة تقريبية تبلغ 500 cells/cm².

عادةً ما يُنتج 12 جرواً من الجرذان ما يكفي لملء 30 طبقاً بقطر 35 مليمتر. تُترك المزارع لتنمو في حضانة المزارع الخلوية لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً. ولتحفيز التطور والإنضاج التشابكي، يُضاف مضاد الانقسام a C لوقف نمو الخلايا الدبقية في اليوم الرابع من الزرع في المختبر (in vitro).

كذلك في اليوم الخامس من الزرع المختبري (in vitro)، قم بإجراء عملية تبديل لنصف الوسط باستخدام وسط neuro basal مع مكمل B 27 لتعزيز بقاء العصبونات خلال فترة النضج هذه. قم بإدخال المعالجات التي تغير عدد المشابك الصامتة قبل المشبكية. وقد وجدنا أن إحدى الطرق المريحة لإسكات نسبة كبيرة من مشابك الغلوتامات هي المعالجة لمدة أربع ساعات باستخدام 30 millimolar من البوتاسيوم.

عندما تنضج المزارع، يجب أن تكون الخلايا العصبية ذات كثافة منخفضة نسبيًا مع استطالات عصبية متباعدة وواسعة. أخرج المزارع من الحاضنة وانقلها إلى طاولة العمل. استبدل الوسط الزرعي بمحلول ملحي منظم يحتوي على 45 millimolar potassium chloride و 10 micromolar FM 1 43 FX die.

يجب أن يحتوي هذا المحلول أيضاً على NBQX و A PV لمنع الإشارات المتكررة. ومن المهم الحفاظ على المحلول المخزن من FM 1 43 FX والتجارب في الظلام لمنع التبييض الضوئي. لذا، قم بتغطية أطباق المزرعة بورق القصدير في جميع خطوات الحضن اللاحقة.

يُحضّن المزيج لمدة دقيقتين بالضبط في درجة حرارة الغرفة. يُزال محلول الصبغة ويُغسل لمدة تتراوح بين ثلاث إلى خمس ثوانٍ فقط باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) يحتوي على 500 micromolar من الـ adversive.Seven. لإزالة الارتباط غير النوعي للصبغة، يُعد التوقيت في هذه الخطوة أمراً بالغ الأهمية.

بما أن التعرض المطول لـ adv adverse F seven سيؤدي إلى إزالة جميع وسم FM 43 FX، قم بغسل الخلايا باستخدام buffered saline الخالي من adv adverse لـ خمس فترات زمنية مدتها دقيقتان داخل خزانة استنشاق الغازات الكيميائية.

قم بتثبيت المزارع في 4% paraldehyde و 0.2% glutaraldehyde في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS. يمكن الآن نقل الخلايا خارج خزانة استخلاص الغازات.

أضف محلول الحجب الذي يحتوي على 4% normal goat serum و 0.04% tritton X لتقليل الخلفية ونفاذية الخلايا من أجل التلوين المناعي. احضن العينات لمدة 15 دقيقة. ثم لوّن الخلايا باستخدام vlu T one antibody مخفف بنسبة 1:2000 في محلول الحجب.

قم بتحضين المزارع في الأجسام المضادة مع الرج اللطيف لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS. حضن الخلايا مع Alexa.

جسم مضاد مضيف لـ Guinea pig مرتبط بـ 6 47 ومخفف بنسبة 1 إلى 500 في محلول الحجب. يتم الحفاظ على المزارع في الجسم المضاد الثانوي مع الرج اللطيف لمدة 30 دقيقة. تُغسل الخلايا أربع مرات إضافية باستخدام PBS.

ضع قطرة صغيرة من كمية الأرض على شريحة زجاجية نظيفة باستخدام الملقط. التقط غطاء الشريحة وأنزله برفق فوق قطرة كمية الأرض بحيث تكون الخلايا مواجهة للشريحة. اترك الشريحة لتجف طوال الليل.

قم بتجهيز عدسة شيئية زيتية بقوة تكبير 60x على مجهر المسح الليزري البؤري. ضع الشريحة على المنصة بحيث يكون غطاء الشريحة مواجهاً للعدسة الشيئية. ابحث عن مجال من الزوائد العصبية بحيث لا يكون كثيفاً للغاية ويكون بعيداً عن جسم الخلية الذي قد يحتفظ بالصبغة المتبقية.

قم بتكبير الصورة حتى يصل حجم الحقل إلى 51 في 51 ميكرون. باستخدام برنامج التقاط الصور، قم بالتقاط مجموعة ZS stack تغطي عمقاً قدره 7.8 ميكرون على مدار 27 خطوة، وبواقع 0.3 ميكرون لكل خطوة.

قم بإجراء المسح أولاً باستخدام الجسم المضاد VLU T one لتحديد جميع المشابك الغلوتاماتيرجية في المجال. ثم أعد المسح لفلورة FM 1 43 FX لتحليل الصور بعد عملية الاستحواذ. استخدم برنامج التحليل لتحويل مجموعة Z tack إلى صورة واحدة مركبة مستوية بناءً على قراءة الكثافة القصوى من أي مستوى عند كل مجموعة بكسلات مع ضبط العتبة.

لتقليل الضجيج في الخلفية، يتم تحديد نهايات VG glu T one دون الرجوع إلى صبغة FM 1 43 effects. ثم يتم تحديد هذه النقاط كـمناطق اهتمام. وعادةً ما نختار 10 نقاط لكل حقل.

كرر عملية تحديد العتبة واختيار النقاط على صورة تأثيرات FM 1 43 وقم بدمج الصور لتحديد المشابك الصامتة. يمكن استخدام معيار بكسل مطلق، أو معيار نسبة مئوية للبكسلات للتمييز بين المشابك النشطة الموجبة لـ FM 1 43 والمشابك غير النشطة السالبة لـ FM 1 43. في مزارعنا، وجدنا أن 70 إلى 80% من مشابك الغلوتامات المحددة بواسطة صبغ V glut one تظهر صبغاً يمكن اكتشافه لـ FM 1 43 في الصور المتراكبة لفلورة FM 1 43 الخضراء وصبغ V glut one الأحمر.

ويتضح ذلك من خلال وفرة النقط الصفراء التي تشير إلى تشابكات عصبية مع وجود علامات مشتركة في نفس الموقع. وقد تم الإشارة إليها بواسطة الأسهم. ما يقرب من 20 إلى 30% من النقط الحمراء الموجبة لـ V glut one ستفتقر إلى الفلورة الخضراء لـ FM 1 43 فوق المستوى الأساسي.

هذه هي النهايات قبل التشابكية غير النشطة، ويشير رأس السهم إلى مثال عليها. ستُلاحظ أيضاً مجموعة ثالثة من المشابك العصبية؛ حيث تظهر هذه المجموعة إيجابية لفلورية FM 1 43 الخضراء، ولكنها تفتقر إلى صبغ B glut one الأحمر.

تمثل هذه المشابك العصبية جاباوية (GABAergic) نشطة، ويشير النجم إلى أحد الأمثلة عليها. يتم استبعاد هذه المشابك من معظم تحليلاتنا، ولكن يمكن دراستها بشكل صريح باستخدام جسم مضاد لناقل GABA الحويصلي. وبدلاً من الجسم المضاد VLU T one، لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تصور المشابك الصامتة قبل المشبكية باستخدام FM 1 43 والتصبيغ المناعي VLU one.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن FM 1 43 FX يتأثر بكل من مدة الغسل بـ adver sub seven وتركيز treating X 100 المضاف إلى محلول الحجب. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وحظاً موفقاً في تجاربكم.