قياس الوصلات العصبية : حدث الفحص كيمياء سيتولوجية مناعية القائم على القياس الكمي للعدد سنبس

يعد فهم الإشارات الجزيئية التي توجه المراحل المبكرة من تكوين التشابكات العصبية أحد أهم الأهداف في علوم الأعصاب. وبناءً على ذلك، أصبح من الضروري تطوير مناهج موضوعية لقياس التغيرات في الاتصال التشابكي. ومن أجل قياس عدد التشابكات العصبية في مجموعة متنوعة من التحضيرات التجريبية، يتم صبغ الخلايا العصبية المستنبتة أو تحضيرات مقاطع أنسجة الدماغ المجمّدة باستخدام علامات انتقائية قبل التشابكية وبعد التشابكية لتحديد نقاط الاتصال التشابكي بين الخلايا العصبية.

يتم بعد ذلك تصوير الخلايا أو الأنسجة باستخدام مجهر فلوري، مع استخراج صور بدقة 8 بت لكل قناة من القنوات المقابلة لعلامات الكيمياء النسيجية المناعية. تُحلل الصور باستخدام برنامج Image J 1.29 مع أداة Puncta Analyzer. ولتحديد مدى التوضع المشترك بين علامات ما قبل التشابك وما بعد التشابك، يمكن استخدام نقاط التوضع المشترك لتحديد عدد التشابكات العصبية الموجودة في العينة.

تتمثل الميزة الرئيسية للتقنية الموضحة هنا مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني، في أن اختبار المشبك العصبي يتيح تحليلاً وقياساً كمياً لعدد المشابك العصبية بإنتاجية أعلى بكثير. وتمتد الآثار الرئيسية لهذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الاضطرابات السريرية مثل مرض الزهايمر، أو الصرع، أو التوحد، والتي تضمنت التشوهات في الاتصال المشبكي كأساس للمرض الأساسي. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد أشكال التدخل التي يمكن أن تقلل أو تحسن القصور الذي نراه في قدرة العصبونات المصابة على تكوين مشابك عصبية مع بعضها البعض.

على الرغم من أن هذه الطريقة مفيدة لدراسة تطور الدماغ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات نموذجية أخرى أو أنظمة عضوية أخرى ترغب في دراستها أو تقدير عدد الاتصالات بين الخلايا فيها، شريطة أن تكون لديك القدرة على وسم كل وجه متقابل من كل موقع اتصال بشكل انتقائي. قم بتحضير المزارع العصبية عن طريق زرع خلايا العقدة الشبكية للجرذ المنقاة من شبكية الجرذ، والتي تم جمعها من حيوانات في مرحلة P5-P7، على شرائح غطاء زجاجية مطلية بـ poly-D-lysine. وفي طبق يحتوي على 24 بئراً، تُترك الخلايا لتنمو عند 37 °C لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى خمسة أيام قبل عملية عفن الخلايا (transfection).

بعد عملية transfection، يتم تحضين الخلايا لمدة تتراوح من سبعة إلى ثمانية أيام إضافية للسماح بنمو التشابكات العصبية عندما تنضج الخلايا المزروعة بشكل كافٍ. يتم إزالة وسط الزرع من الآبار وإضافة 500 µL من para formaldehyde بتركيز 4% المسخن مسبقاً إلى كل بئر للتثبيت لمدة سبع دقائق. بعد التثبيت وفي درجة حرارة الغرفة، يتم شطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام phosphate buffered saline.

من المهم التأكد من عدم السماح بجفاف الخلايا مطلقاً داخل الآبار. وبمجرد إزالة المنظم من البئر، يجب استبداله فوراً بالمنظم التالي. قم بتحضير منظم الحجب الذي يحتوي على 50%normal goat serum و 0.2%Triton X 100.

بعد إزالة PBS من كل بئر، يتم إضافة 200 µL من محلول الحجب (blocking buffer) إلى كل بئر والحجب لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة، يُزال محلول الحجب ويتم الشطف ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم يتم تحضير تخفيف للأجسام المضادة الأولية في محلول مكون من 90% من محلول الأجسام المضادة و10% من محلول NGS الذي يحتوي على زوج الأجسام المضادة المختار لما قبل وما بعد التشابك العصبي.

هنا يتم استخدام جسم مضاد أرنبي ضد synapsin، وهو علامة قبل مشبكية، وجسم مضاد فأري ضد homer، وهو علامة بعد مشبكية. يتم طرد تخفيف الجسم المضاد الأولي مركزياً لمدة خمس دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي مكتبي لإزالة أي جسم مضاد مترسب، ثم يُضاف 200 µL من محلول الجسم المضاد الأولي إلى كل بئر. توضع الصفيحة في حاوية مرطبة لمنع جفاف المحلول الأولي.

يُحضن العينة طوال الليل عند درجة حرارة أربعة درجات Celsius بعد التحضين مع الجسم المضاد الأولي. تُشطف كل بئر ثلاث مرات. وباستخدام PBS، يُضاف 200 µL من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، والمخففة بنسبة 1 إلى 1000 في محلول منظم للأجسام المضادة يحتوي على 10% NGS مُحضّر.

كما سبق، ضع الطبق في الغرفة المرطبة واحضه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام بعد الحضن مع الأجسام المضادة الثانوية. اشطف كل بئر من ثلاث إلى أربع مرات باستخدام PBS. ضع قطرة من وسط التثبيت vector shield مع DPI على شريحة زجاجية.

بعد ذلك، اقلب غطاء الشريحة الذي يحتوي على الخلايا فوق القطرة للتثبيت. وأخيراً، ضع طلاء أظافر شفافاً حول حواف غطاء الشريحة. احرص على تجنب دفع أو تحريك أغطية الشرائح أثناء عملية التطبيق.

بما أن هذه العملية ستؤدي إلى تشتت الخلايا، اترك الشرائح لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في مكان جاف ومظلم. هنا، يتم التصوير باستخدام مجهر الفلوريسنت zes axio imager المجهز بمجموعات مرشحات مناسبة وعدسة شيئية غمر زيتية بقوة 63 مرة. ضع شريحة تحتوي على خلايا غير منقولة على منصة المجهر.

باستخدام مجموعة مرشحات DPI لتصوير نوى الخلايا، اختر الخلايا التي تبعد عن أقرب جيرانها بمسافة تعادل قطري خلية على الأقل. سيساعد استخدام DPI في هذه الخطوة على تجنب التحيز وضمان عشوائية اختيار الخلايا. لكل خلية مختارة، قم بالحصول على صور بدقة 8-bit باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة، وفي هذه الحالة، GFP وTexas Red.

يجب أن تظهر الصورة ذات الألوان الاصطناعية المتراكبة علامات ما قبل المشبك وما بعد المشبك باللونين الأحمر والأخضر على التوالي. بعد ذلك، ضع شريحة تحتوي على خلايا محولة جينيًا على منصة المجهر. في هذه الحالة، تم تحويل الخلايا باستخدام ناقل تعبير TD tomato.

استخدم هذا المؤشر لاختيار الخلايا كما سبق. لكل خلية مختارة، يتم الحصول على ثماني صور للوهاد باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة في هذه الحالة، وهي GFP وTexas Red وSci five. يجب أن تظهر الصورة المدمجة ذات الألوان الزائفة علامات ما بعد التشابك باللون الأحمر والأخضر والأزرق.

هنا، يتم استخدام برنامج محلل النقاط (puncture analyzer) لتقدير كمية النقاط التشابكية المتزامنة في الموقع. وقد قام Barry Walk بكتابة الملحق الخاص بمحلل النقاط (Puncta analyzer)، وهو متاح عند الطلب في إصدار image J 1.26. قم بفتح إحدى الصور التي تم جمعها.

استخدم أداة التحديد الدائري لتحديد منطقة بنطاق قطر خلية واحدة تقريبًا بشكل شعاعي حول الـ SOR المطلوب. بعد تحديد المنطقة المستهدفة، انتقل إلى قائمة المكونات الإضافية (plugins) واختر محلل الثقوب (puncture analyzer)؛ وفي نافذة خيارات التحليل التي تظهر، حدد القناة الحمراء (Red Channel) والقناة الخضراء (Green Channel). أولاً، قم بطرح الخلفية وحدد ملف النتائج.

انقر على موافق. ثم حدد الموقع الذي تريد حفظ النتائج فيه. ويمكن تصدير هذه النتائج إلى Excel لإجراء مزيد من التحليل من خلال النافذة التي تظهر.

بعد ذلك، تأكد من اختيار نصف قطر كرة دحرجة (rolling ball radius) بقيمة 50 وإلغاء تحديد خيار الخلفية البيضاء. هذا التعديل ليس مطلوباً ولكن غالباً ما يفضله مستخدمو التطبيق. ولتسهيل التصور البصري، انقر موافق.

ستظهر نافذة جديدة بجانب قناع يتوافق مع صورة القناة الحمراء. قم بضبط العتبة حتى يتطابق القناع الأحمر قدر الإمكان مع أكبر عدد من الثقوب المنفردة والمتميزة. انقر على "تم" دون إدخال الكثير من الضوضاء.

اضبط الحد الأدنى لحجم النقاط على أربعة بكسل. لا تقم بتعديل أي شيء آخر. انقر موافق.

كرر الخطوة السابقة هذه المرة للقناة الخضراء. بعد تكرار ذلك مع القناة الخضراء، سيقدم الملحق البرمجي قياساً كمياً يتوافق مع النقاط (puncta) في كل قناة على حدة، والنقاط المتوطنة معاً (co localized puncta) بين القناتين. يمكن تطبيق مقايسة المشبك العصبي الموضحة هنا على المقاطع المجمدة من الدماغ وعلى أي نسيج آخر من الجهاز العصبي مثل النخاع الشوكي أو الشبكية.

شريطة توفر زوج مناسب من المؤشرات قبل المشبكية وبعد المشبكية. ابدأ بجمع أنسجة الدماغ من فأر تم قتله رحيماً عن طريق استنزاف الدم والغسل بـ PBS. ضع الدماغ كاملاً في 4%paraldehyde في PBS عند درجة حرارة أربع درجات Celsius طوال الليل حتى اليوم التالي.

اشطف الدماغ ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بحماية الدماغ من التجمد عن طريق وضعه في محلول 30%sucrose في PBS.

سوف تطفو الأنسجة في البداية مع الحفاظ عليها عند درجة حرارة 4 °C حتى تغرق الأنسجة إلى القاع. وعند هذه المرحلة، تكون عملية الحماية بالتجميد قد اكتملت. بعد ذلك، يتم غمر الدماغ في محلول بنسبة اثنين إلى واحد من 20% sucrose وOCT وPBS، مع توجيهه بالوضعية المطلوبة لعملية التقطيع.

على سبيل المثال، المقطع السهمي أو الإكليلي. بعد ذلك، ضع سطحاً معدنياً مسطحاً فوق دلو من الثلج الجاف. ضع الدماغ المغمّد عليه ليتجمد، وبمجرد تجمده، انقل الدماغ إلى كيس تجميد وضعه في درجة حرارة 80- °C لمدة تصل إلى عام قبل البدء في عملية التقطيع.

باستخدام جهاز الميكروتوم مبرد الحرارة (cryostat)، قم بتقطيع النسيج إلى مقاطع يتراوح سمكها من 12 إلى 16 ميكرون وثبتها على شرائح زجاجية. بعد ذلك، جفف الشرائح بوضعها في فرن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم اشطفها ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة بقايا مركب OCT.

يُستخدم قلم البارافين لإنشاء حاجز كاره للماء حول الشريحة، ثم يُضاف محلول الحجز إلى الشريحة بحيث يمنع إطار البارافين تدفقه خارجها. تُوضع الشرائح في 20% normal goat serum في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لغرض الحجز، ثم تُوضع المقاطع في أجسام مضادة أولية مُخففة في PBS مع 0.3% triton و 10% normal goat serum.

هنا، يُستخدم الجسم المضاد للأرنب ضد PSD 95 لوسم المقصورات ما بعد التشابكية غلوتاماتيرجية، بينما يُستخدم الجسم المضاد لخنزير غينيا ضد v glu two لوسم النهايات ما قبل التشابكية غلوتاماتيرجية. توضع الشرائح عند درجة حرارة 4 °C وتُحضن لمدة تتراوح بين 36 إلى 60 ساعة. بعد انتهاء فترة التحضين، يُغسل الجسم المضاد الأولي عن طريق غمر الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة.

بعد هذه الخطوة، تأكد من حماية الشرائح من الضوء المباشر. أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة بنسبة 1:200 في محلول PBS مع 0.3%triton و10%normal goat serum. في هذه الحالة، يتم استخدام goat anti Guinea pig.

تُستخدم Alexa 4 8 8 و goat anti rabbit و Alexa 5 9 4. تُحضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

اغسل الشرائح عن طريق غمرها أربع مرات في PBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة تمهيداً للتثبيت. أضف قطرات صغيرة من وسط التثبيت vector shield باستخدام dappy وغطِّ الشرائح بـ cover slips. ضع طلاء الأظافر لمنع تحرك الـ cover slips.

يجب إجراء تصوير للمقاطع النسيجية باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مع الليزرات المناسبة، وباستخدام عدسة شيئية غاطسة في الزيت بقوة 63 مرة لكل صورة مقطع، مع أخذ مقاطع بصرية متسلسلة بفاصل 0.33 micron على عمق إجمالي قدره خمسة microns، ليصبح المجموع 15 مقطعاً بصرياً. يجب تصوير ثلاثة مقاطع على الأقل من كل حيوان، وإشراك ثلاثة حيوانات على الأقل من كل حالة تجريبية معينة. ثم يتم إنشاء مساقط ذات كثافة قصوى (maximum intensity projections) من مجموعات مكونة من ثلاثة مقاطع متتالية، مما ينتج عنه خمسة مساقط يمثل كل منها عمقاً قدره micron واحد.

يتم قياس هذه الكميات باستخدام برنامج Image J كما هو موضح بالنسبة لخلايا RG Cs مع تعديل منطقة الاهتمام (ROI) لتحديد عدد المشابك العصبية المتكونة في غياب الخلايا النجمية. تم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على خلايا rgc مفككة ومعالجة بوسط نمو أساسي باستخدام أجسام مضادة ضد bassoon الموضحة باللون الأحمر وhomer الموضحة باللون الأخضر كما هو متوقع. لوحظ وجود نقاط قليلة جداً من التوضع المشترك المشبكي؛ ولتحديد تأثير الجزيئات التي تفرزها الخلايا النجمية على عدد المشابك المتكونة في المختبر، تمت معالجة خلايا RG Cs مفككة بأوساط مشروطة من خلايا نجمية فئرانية كل ثلاثة أيام لمدة إجمالية قدرها 12 يوماً عقب عملية الصبغ.

كانت العديد من المشابك العصبية واضحة في هذا العصبون، ولكن يظهر soon باللون الأحمر. ويظهر Homer باللون الأخضر. عولجت خلايا RDCs المنفصلة والمعدلة وراثياً ببروتين Lee السيتوبلازمي الذي يعبر عن TD tomato باستخدام وسط نمو أساسي فقط، ولا تظهر المشابك العصبية.

يظهر طماطم TD باللون الأزرق والمشبك العصبي باللون الأحمر. ويُلاحظ وجود إشارة ضئيلة جداً للمؤشر ما بعد المشبكي homer الموضح باللون الأخضر. وعندما تُعالج الخلايا نفسها بشكل مزمن بوسط مُكيّف من الخلايا النجمية للجرذان، تظهر العديد من المشابك العصبية.

يظهر TD tomato باللون الأزرق، وsynapsin باللون الأحمر، وhomer باللون الأخضر هنا. وتظهر خلية RGC منقاة تم معالجتها بوسط مكيف من الخلايا النجمية (astrocyte conditioned medium)، حيث صُبغت لعلامات ما قبل التشابك العصبي باللون الأحمر وعلامات homer ما بعد التشابك العصبي باللون الأخضر؛ وتتوافق أقنعة العتبة الناتجة عن برنامج puncture analyzer مع القناتين الموجودتين. وعند تحديد نقاط التوضع المشترك، يصدر برنامج Puncta analyzer تمثيلاً رسومياً لهذه النقاط.

يوفر برنامج تحليل النقاط (puncta analyzer) مخرجاً رقمياً يشير إلى عدد النقاط المنفصلة التي تم تحديدها في كلتا القناتين ونقاط التوضع المشترك. توضح البيانات الناتجة عن تحليل هذه العصبونة قدرة الجزيئات التي تفرزها الخلايا النجمية على تعزيز تكوين المشابك العصبية، وهو ما يظهر هنا كاختبار للمشابك العصبية حيث تم قياس التوضع المشترك للوسم الكيميائي النسيجي المناعي قبل المشبكي وبعد المشبكي لإثبات تعزيز تكوين المشابك الناجم عن الخلايا النجمية من خلال الإفراط في التعبير عن المستقبل العصبي لجزيء thrombospondin المولد للمشابك والمفرز من الخلايا النجمية. يوضح هذا الشكل متوسط عدد المشابك لكل عصبونة عولجت بشكل مزمن بوسط نمو أساسي (gm) أو بوسط مشروط من الخلايا النجمية.

يعزز A-C-M-A-C-M تكوين المشابك العصبية في خلايا العقد الشبكية التي تعبر بشكل مفرط عن مستقبل thrombo spon بقوة أكبر مقارنة بالخلايا التي تعبر بشكل مفرط عن ناقل فارغ. ولتقدير كثافة المشابك العصبية في الأكيمة العلوية للفأر، تم وسم الحجرات قبل المشبكية وبعد المشبكية بشكل منفصل باستخدام علامات كيميائية نسيجية مناعية خاصة بكل حجرة. وكما هو موضح هنا، حدثت زيادة في عدد المشابك العصبية من اليوم السابع بعد الولادة إلى P 14.

يوضح هذا الزيادة في عدد المشابك العصبية في القشرة العلوية خلال هذه النافذة الزمنية التنموية. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن إكماله في غضون يومين تقريبًا للمزارع العصبية المفككة، وحوالي خمسة أيام لقطاعات الدماغ التي يتم الحصول عليها من الحيوان باتباع هذا الإجراء. وتُستخدم طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية والمجهر الإلكتروني للتحقق من أن التغيرات في عدد المشابك تعكس تغيرات في كل من المشابك الوظيفية والمشابك الطبيعية من الناحية البنيوية الدقيقة على التوالي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تطبيق الكيمياء النسيجية المناعية على تحضيراتك التجريبية لتقدير عدد المشابك العصبية كمياً. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية استخدام أجسام مضادة متخصصة في مقصورات معينة لوسم المقصورات قبل المشبكية وبعد المشبكية بشكل انتقائي. وفي هذا السياق، نُعرف المشابك العصبية بأنها نقاط التوضع المشترك بين الإشارات التي يتم الحصول عليها من كل من هذه العلامات.