الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

يوضح هذا الفيديو بروتوكولاً لتصوير تكرار DNA باستخدام المجهر الضوئي واسع المجال باستخدام DNA لامدا خطي ومعدل كيميائياً. يتم ربط DNA بشريحة زجاجية مغطاة وموظيفية. يتم وسم الطرف الحر لـ DNA بخرزة، ثم يتم تمديد DNA بواسطة التدفق الصفائحي.

عند بدء عملية التضاعف، يبدأ الشريط الرائد في الاستطالة بينما يقصر الشريط المتأخر بسبب الالتفاف. ويسمح الفرق الكبير في الطول بين الحمض النووي DNA مزدوج الشريط وأحاد الشريط عند القوى المنخفضة بالمراقبة المباشرة لتحولات DNA أثناء التضاعف. كما يتم رصد طول بنية DNA من خلال تتبع موضع الخرزة، مما يتيح تحديداً دقيقاً لمعدل وعملية تضاعف DNA.

مرحباً، أنا آري أولريش من مختبري أنطوني فانيان وتشارلز ريتشاردسون في قسم الكيمياء البيولوجية وعلم الصيدلة الجزيئي في كلية الطب بجامعة هارفارد. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير تضاعف DNA على المستوى الجزيئي المنفرد. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبراتنا لدراسة الأنشطة الإنزيمية التي تحدث أثناء تخليق DNA.

لنبدأ الآن. في بداية هذا الإجراء، يتم تعديل الحمض النووي لـ DNA الخاص بـ lambda linearized bacteria phage بواسطة oligonucleotides قصيرة لتكوين شوكة تضاعف، وذراع شوكة مكملة لـ lambda، وذراع شوكة مبيوتنة، وبادئ للشوكة. تحتوي ذراع الشوكة المبيوتنة على biotin متصل بنهايتها '5، مما يسمح بربط قالب DNA بسطح خلية التدفق.

يتم تعديل DNA lambda بشكل إضافي عن طريق التهجين مع قليل نيوكليوتيد آخر يحتوي على شق diggenin يعمل كعلامة مناعية عالية الألفة لربط الخرزة. ولتوليد شوكة التضاعف، يتم الحصول على DNA lambda بالإضافة إلى عدة قليلات نيوكليوتيد يمكن العثور على تسلسلاتها في البروتوكول المكتوب المصاحب لهذا الفيديو. وتشمل هذه القليلات النيوكليوتيدية ذراع شوكة مبيوتينية، وذراع شوكة مكمل لـ lambda، وبادئ شوكة، ونهاية diggenin مكملة لـ lambda؛ ثم يتم فسفرة النهايات '5 لذراع الشوكة المكمل لـ lambda والنهاية diggenin المكملة لـ lambda باستخدام T4 polynucleotide kinase.

بعد ذلك، اخلط ذراع الشوكة المكملة لـ lambda المفسفرة، وذراع الشوكة المبيوتنة، وبادئ الشوكة، و DNA lambda بنسبة مولية تبلغ 10 إلى 10 إلى 100 إلى واحد. في منظم T4 DNA Ligase، سخن الخليط عند 65 °C لمدة خمس دقائق ثم برده ببطء حتى درجة حرارة الغرفة عن طريق إيقاف تشغيل الكتلة الحرارية للسماح بالتهجين الصحيح للأوليغونوكليوتيدات و T4 DNA ligase في الخليط، ثم حضنه لمدة ساعتين. في درجة حرارة الغرفة، سيقوم T4 DNA Ligase بتحفيز سد الشقوق الموجودة بين الأوليغونوكليوتيدات و lambda.

أخيراً، يتم ربط الطرف المتمم لـ lambda diggen إلى قالب تكرار DNA عن طريق إضافة الطرف المتمم لـ lambda diggen المفسفر في محلول T four Ligase buffer؛ يُحضن المزيج لمدة 30 دقيقة عند 45 درجة مئوية، ثم يُبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق إيقاف تشغيل الكتلة الحرارية. يتم ربط الطرف المتمم لـ Lambda dig oxygen المفسفر بقالب تكرار DNA عن طريق إضافة T four DNA ligase إلى المزيج، والحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وبذلك يصبح قالب تكرار DNA النهائي جاهزاً للاستخدام. ومن أجل ربط الخرزات المغناطيسية المنشطة بـ tassel بقالب تكرار DNA، يجب وظيفتها باستخدام قطعة FAB مخصصة لـ digo genin.

لبدء هذه العملية، قم بإعادة تعليق المحلول المخزون من الخرزات وانقل 400 µL إلى أنبوب إبيدور. ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واتركه حتى يتصفى المحلول. ثم قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الماصة. ولتنشيط مجموعات التوال للربط بالأجسام المضادة، أضف 1 mL من منظم البويد وامزجه بلطف عن طريق الماصة.

مرة أخرى، قم بإزالة السائل الطافي بمساعدة فاصل مغناطيسي. بعد ذلك، أضف 240 µL من قطعة FAB وأعد تعليق الخرزات في 400 µL من محلول البورات المنظم. اخلط جيداً واترك العينة لتتحضن على جهاز تدوير لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة عند 37 °C.

بعد التحضين، افصل الخرزات باستخدام الفاصل المغناطيسي وأزل السائل الطافي. اغسل الخرزات باستخدام 1 mL من محلول الغسيل المنظم وحضنها لمدة خمس دقائق عند 4 °C، ثم أزل المحلول المنظم باستخدام الفاصل المغناطيسي. تكرر عملية الغسل هذه مرتين.

لحجب مجموعات التوسيل الحرة، أضف 1 mL من BSA المحتوي على منظم تريس (tris buffer) وحضّن لمدة أربع ساعات عند 37 °C. وبعد الحضن، قم بإزالة المنظم من الخرزات باستخدام فاصل مغناطيسي، واغسل مرتين بالمنظم ثم قسم العينة إلى حصص. وللاستخدام، يتم تثبيت DNA المراد تكراره على شرائح زجاجية غطائية مُعالجتها وظيفياً بـ Amil lane.

ترتبط مجموعة الأوكسي في Amil lane بالزجاج، مما يترك مجموعة أمين متاحة للارتباط بجزيئات peg المبيوتينية. يساعد هذا الطلاء في تقليل الارتباط غير النوعي بالسطح. ولتنظيف شرائح الغطاء الزجاجية جيداً، ضعها في أواني صبغ واملأ الأواني بالإيثانول ثم استخدم جهاز التنظيف بالموجات فوق الصوتية (sonicate).

قم بشطف الجرار لمدة 30 دقيقة، ثم املأها بمحلول هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز one molar واستخدم جهاز الموجات فوق الصوتية (sonicate) لمدة 30 دقيقة، وكرر عمليتي الغسل كلتيهما. بالنسبة لتفاعل الوظيفية الأول، يجب إزالة جميع آثار الماء. املأ جرار الصبغ بالأسيتون واستخدم جهاز الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.

قم بتفريغ الجرار ثم املأها مرة أخرى بالأسيتون. انتقل بعد ذلك لإضافة كاشف الساين إلى الجرار مع الرج لمدة دقيقتين. ثم قم بإخماد التفاعل بإضافة فائض كبير من الماء.

بعد ذلك، يتم تجفيف شرائح التغطية عن طريق خبزها في الفرن عند 110 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحضير خليط peg بتركيز 0.2% weight per volume تقريبًا. سيتيح peg المبيوتين (Biotinylated peg)، بما في ذلك فاصل شريحة التغطية الزجاجية، فصل شرائح التغطية؛ لذا قم بنقل 100 microliters بواسطة الماصة على شريحة تغطية جافة ومعالجة بالسيلان (siloized).

ضع غطاءً زجاجياً ثانياً في الأعلى. يتم تحضين الأغطية الزجاجية في محلول PEG لمدة ثلاث ساعات. ثم افصل كل زوج من الأغطية الزجاجية واغسلها جيداً بالماء.

احرص على إبقاء غطاءات الشرائح بحيث يكون الجانب الوظيفي متجهًا للأعلى، حيث سيتم طلاء جانب واحد فقط بـ peg. وأخيرًا، جفف غطاءات الشرائح باستخدام الهواء المضغوط واحفظها تحت تفريغ هوائي في مجفف؛ حيث تظل الأسطح مستقرة لمدة شهر على الأقل. وبذلك يمكن تحضير العشرات من غطاءات الشرائح في دفعة واحدة واستخدامها حسب الحاجة.

بعد أن أصبحت شرائح التغطية جاهزة، يمكن الآن تجميع غرفة التدفق الخاصة بتجربة الجزيء الواحد. تُجرى تجربة الجزيء الواحد باستخدام غرفة تدفق بسيطة مكونة من شريحة تغطية مُوظيفَة، وشريط لاصق مزدوج الوجه، وشريحة كوارتز، وأنابيب. يتم تحضير غرفة تدفق واحدة لكل تجربة جزيء واحد.

ابدأ بخلط 5 mL من محلول الحجب (blocking buffer) و20 mL من محلول العمل (working buffer)، ثم ضع الخليط في مجفف (desiccator) لإزالة أي فقاعات هوائية تمهيداً للخطوات اللاحقة. بعد ذلك، قم بتوزيع 100 µL من محلول عمل strp din في PBS على سطح الشريحة الغطائية (Cover slip) الوظيفية ذات الأوتاد، ثم حضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لـ strp din بالارتباط بالبيوتين السطحي. وفي هذه الأثناء، قص قطعة من الشريط اللاصق ذو الوجهين لتناسب حجم شريحة الكوارتز، وحدد موقع فتحات الأنابيب على الشريط.

حدد مخطط غرفة التدفق عن طريق رسم قناة مركزية بعرض ثلاثة مليمترات ومستطيلات تحتوي على كلتا الفتحتين. يمكن تصميم غرف التدفق بقناتين للدخول وقناتين للخروج على شكل حرف y. الآن، قم بقص الشريط المحدد وفقاً للمخطط المرسوم، مع إجراء قصات مستقيمة ونظيفة للتأكد من عدم بروز أي مادة لاصقة داخل القناة.

نظف الشريحة الكوارتزية جيداً باستخدام الأسيتون لإزالة المادة اللاصقة الناتجة عن بناء خلية التدفق المستخدمة في التجارب السابقة. حدد أفضل محاذاة لمخطط القناة. قم بإزالة أحد جانبي البطانة اللاصقة وضع الشريط بعناية على الشريحة الكوارتزية.

احرص على محاذاة الشريط بشكل صحيح لضمان بقاء فتحتي المدخل والمخرج غير مسدودتين. بعد ذلك، قم بتجهيز أطوال الأنابيب المقطوعة بقطر داخلي 0.76 millimeter لمدخل ومخرج خلية التدفق. اقطع طرف الأنبوب بزاوية 30 درجة تقريبًا حتى لا يضغط الأنبوب بشكل مسطح على قاع الغرفة.

قم بتعليق الأنابيب على رفوف أنابيب الاختبار لتسهيل توصيلها بخلية التدفق في الخطوات التالية. وفي هذه المرحلة، يجب أن تكون عملية تحضين شريحة الغطاء قد اكتملت. اشطف شريحة الغطاء جيداً بالماء وجففها باستخدام الهواء المضغوط.

احذر من قلب غطاء الشريحة، حيث أن جانباً واحداً فقط هو الذي تمت وظيفته باستخدام peg. أكمل تجميع غرفة التدفق عن طريق إزالة الجانب الآخر من الغطاء اللاصق ووضع شريحة الكوارتز فوق غطاء الشريحة. اضغط برفق على غطاء الشريحة لطرد أي هواء محبوس في المادة اللاصقة، حيث سيساعد ذلك في منع وصول أي فقاعات هوائية إلى قناة التدفق.

قم بسد جوانب الغرفة باستخدام مادة الإيبوكسي. أدخل الأنابيب المقطوعة في فتحات الكوارتز وثبتها في مكانها باستخدام الإيبوكسي. اتركها لتجف لبضع دقائق.

بمجرد أن تجف، استخدم إبرة قياس 21 لسحب جزء من محلول الحجب (blocking buffer) الخاص بـ DGAs عبر أحد الأنابيب من أجل حجب سطح الغرفة. قم بعملية الغسل عدة مرات لإزالة الفقاعات الهوائية، واترك الغرفة لتحضن لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الانتقال إلى تجربة تضاعف الجزيء الواحد. وبمجرد تحضير الخرزات الوظيفية لقالب DNA وغرفة التدفق، يمكن إجراء تجربة الجزيء الواحد.

للبدء، ضع خلية التدفق على منصة المجهر. ثبت الغرفة في مكانها باستخدام مشابك المنصة وتأكد منما يتوافق وضع قناة التدفق مع كاميرا CCD. قم بالتوصيل بنظام دفع الهواء الذي تم إنشاؤه مسبقاً بمضخة السرنجة وبأنابيب المخرج الخاصة بخلية التدفق.

باستخدام أنابيب توصيل ذات قطر أكبر، ضع أنابيب الإدخال الخاصة بخلية التدفق في محلول الحجب، ثم اسحب المكبس في السرنجة لإزالة أي فقاعات هواء من الأنابيب، وانقر برفق على أنابيب الإخراج للتخلص من أي فقاعات هواء محبوسة داخل خلية التدفق. بمجرد إزالة جميع فقاعات الهواء، قم بسد أحد أنابيب الإدخال باستخدام إبرة، وأغلق أحد أنابيب الإخراج عن طريق ثنيه بزاوية 180 درجة وتثبيته بشريط لاصق. قبل إضافة DNA إلى الخلية، خفف قالب DNA المخزون إلى تركيز 10 picomolar في 1 milliliter من DGAs one x blocking buffer. قم بتدفق القالب إلى الغرفة بمعدل تدفق معتدل لضمان تغطية جيدة لسطح الـ DNA.

قم بتخفيف محلول الخرز المركز ليصل تركيزه إلى ما بين 2 و 4 × 10⁶ خرزة لكل ملليلتر في 1 ملليلتر من منظم الحجب (blocking buffer) لـ DGAs بتركيز 1x. ثم قم برج المزيج باستخدام جهاز vortex واستخدم جهاز الموجات فوق الصوتית (sonicate) لمدة 20 ثانية.

قم بتدفق محلول الخرزات المخفف إلى الحجرة. وبمجرد إضافة الخرزات، أوقف التدفق واترك الحجرة لتصل إلى حالة التوازن. ثم أغلق كلا أنبوبي المخرج.

أي تغييرات تطرأ على الأنابيب دون إغلاق الغرفة ستؤدي إلى تقلبات في الضغط تسلط قوة كبيرة على الخرزات وتتسبب في قص جزيئات DNA المربوطة. قم بسد أنبوب المدخل الذي استُخدم لتحميل الخرزات بإبرة باستخدام أنبوب المدخل الثاني. ابدأ بغسل خلية التدفق باستخدام محلول DGAs بتركيز 1x من محلول غسيل المنظم الحاصر (blocking buffer) بشكل مكثف.

قم بهز المنصة عن طريق النقر لإزالة أي حبيبات ملتصقة بالسطح بشكل غير نوعي للتحقق منها. تكون الحبيبات مرتبطة بـ DNA. حاول تغيير اتجاه التدفق.

بمجرد إزالة الخرزات الحرة بشكل كافٍ، أوقف التدفق واترك الغرفة لتصل إلى حالة التوازن. قم بتحضير خليط تفاعل جديد يحتوي على بروتينات التضاعف كما هو موضح في البروتوكول النصي. أغلق أنبوب المخرج المفتوح وقم بتحويل خزان المدخل إلى خليط التفاعل المُحضّر حديثاً.

افتح المخرج ببطء لتجنب التغيرات السريعة في الضغط للمضي قدماً في التفاعل الإنزيمي. أولاً، قم بتدفق محلول البروتين إلى الغرفة بمعدل تدفق متوسط للسماح بالارتباط الفعال بالـ DNA. أوقف التدفق واترك الغرفة لتصل إلى حالة التوازن.

أغلق أنابيب المخرج واستبدل الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل. وباستخدام الأنبوب الذي يحتوي على محلول غسيل DGAs المنظم، اغسل الغرفة لإزالة البروتينات الحرة بعد عملية الغسل. مرة أخرى، أوقف التدفق واترك الغرفة حتى تصل إلى حالة التوازن.

أغلق أنابيب المخرج واستبدل الأنبوب الذي يحتوي على محلول الغسيل المنظم. باستخدام الأنبوب الذي يحتوي على محلول T seven replication buffer، حيث يحتوي محلول T seven replication buffer على كلوريد المغنيسيوم الذي يحفز بدء تفاعل التضاعف. استخدم معدل تدفق قدره 0.012 milliliters per minute والذي يتوافق مع قوة سحب قدرها three pico Newin على روابط الـ DNA باستخدام الظروف الموضحة في هذا البروتوكول.

ضع مغناطيساً دائماً من العناصر الأرضية النادرة فوق خلية التدفق قبل التصوير لمنع التفاعلات غير النوعية بين الخرزات والسطح. قم بتوجيه مُنير ليفيّ بزاوية سقوط تتراوح بين 10 درجات وموازاة منصة المجهر بالقرب من مجال رؤية المجهر مع استخدام عدسة شيئية 10x وكاميرا CCD. يُستخدم إضاءة المجال المظلم لزيادة التباين في بؤرة تصوير الخرزات باستخدام خرزة مقيدة.

ابدأ عملية تجميع البيانات لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة بمعدل إطارات بطيء. في التجربة الناجحة، يمكن ملاحظة 100 خرزة في آن واحد. يجب أن تنتج التجربة العديد من المسارات التي تظهر تخليق الحمض النووي DNA للشريط الرائد.

من أجل قياس معدلات واستمرارية فك التواء الحمض النووي DNA وبلمرته، يجب تحديد المواقع الدقيقة للخرزات لتحقيق ذلك. قم بمطابقة هذه المواقع باستخدام دالات Gaussian ثنائية الأبعاد. قم بتصور المسار عن طريق تتبع موقع الخرزة في كل إطار باستخدام برنامج تتبع.

بعد ذلك، قم برسم موضع الخرزة كدالة في الزمن باستخدام أي برنامج رسومي للحصول على بيانات المعدل. قم بمطابقة الرسوم البيانية باستخدام الانحدار الخطي واحسب الميل للعملية المتقدمة. حدد الطول الإجمالي للحمض النووي DNA من بداية حدث التقصير حتى نهايته.

اجمع كل القياسات الفردية وقم برسم توزيعات المعدل والإنتاجية مع مواءمة البيانات باستخدام دوال غاوس والدوال الأسية المنفردة على التوالي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية قياس معدلات وعمليات تضاعف DNA على مستوى الجزيء الواحد. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن القوة والتوتر الناتجين عن التدفق الصفائحي لا يؤثران على الأنشطة الإنزيمية لبروتينات التضاعف.

هذا كل شيء. شكراً للمتابعة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.