تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

في هذه التقنية، يتم وظيفياً تعديل شرائح غطاء زجاجية باستخدام مزيج من جزيئات peg الخاملة والبيوتين. ويتم إنشاء خلية تدفق بهذا السطح المعدل ووضعها على مجهر turf. ثم يتم تثبيت قوالب الدائرة المتدحرجة المبيوتنة على السطح باستخدام الستريبتاديفين متعدد التكافؤ.

عندما يتم تكرار الركائز عن طريق إضافة بروتينات منطقة التضاعف والنيوكليوتيدات، يتم تمديد الحمض النووي DNA مزدوج الشريط الناتج بتدفق صفيحي وتصويره في الوقت الفعلي باستخدام صبغة تداخلية. مرحبًا، أنا ناثان تانر من مختبر أنطوان فان نوين في قسم الكيمياء البيولوجية وعلم الصيدلة الجزيئية في كلية الطب بجامعة هارفارد. وأنا جو لارو، أيضًا من مختبر فان نوين.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الفلوري لتضاعف DNA في الوقت الفعلي على مستوى الجزيء الواحد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أنشطة تخليق DNA المنسقة لمعقدات التضاعف الفردية. لذا، لنبدأ الآن.

لبدء هذا الإجراء، قم بإجراء عملية التلدين (annealing) لأوليغو الذيل المبيوتني (biotinylated tail oligo) مع الحمض النووي DNA أحادي السلسلة M 13 عن طريق إضافة فائض من الأوليغو بمقدار عشرة أضعاف في منظم TBS، والتسخين إلى 65 درجة مئوية، ثم إيقاف تشغيل وحدة التسخين للسماح بالتبريد البطيء لضمان تلدين البادئ بشكل صحيح. وبعد أن يصبح بادئ M 13 جاهزاً، أضفه إلى خليط من T7 DNA polymerase بتركيز 64 nanomolar ومنظم T7 replication buffer الذي يحتوي على dNDPs وكلوريد المغنيسيوم، ثم حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. وفي نهاية فترة التحضين، قم بإيقاف التفاعل بإضافة 100 millimolar EDTA.

بعد ذلك، قم بتنقية منتج DNA المعبأ باستخدام استخلاص الفينول والكحول الإيزواميلي والكلوروفورم، ثم قم بالديلزة في منظم TE أو أي منظم تخزين مناسب آخر، مع إعادة استخلاص كل طور عضوي لاستعادة أي مادة أولية متبقية. بعد الديلزة، حدد تركيز DNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV vis spectrophotometer). يمكن لعملية واحدة من تحضير القالب أن تنتج تركيزاً نانومولارياً من القالب يكفي لإجراء مئات أو آلاف من تجارب الجزيء الواحد.

بعد أن أصبح الحمض النووي DNA جاهزاً، انتقل إلى تحضير شرائح الغطاء الوظيفية. يتم ربط DNA المراد تكراره بشرائح غطاء زجاجية تمت معالجتها وظيفياً باستخدام Amil Lane، حيث ترتبط مجموعة Oxy الموجودة في Amil بالزجاج مما يترك مجموعة أمين متاحة لربط جزيئات peg المبيوتنة. وتساعد هذه الطبقة في تقليل الارتباط غير النوعي بالسطح.

لتنظيف الشرائح الزجاجية الغطائية بشكل تام، ضعها في أوعية صبغ واملأ الأوعية بالإيثانول ثم استخدم جهاز سونيكيت. لمدة 30 دقيقة، قم بتفريغ الأوعية وملئها بمحلول هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز واحد مولار، ثم استخدم جهاز سونيكيت لمدة 30 دقيقة وكرر عمليتي الغسل. بالنسبة لتفاعل الوظيفية الأول، يجب إزالة جميع آثار الماء.

املأ أوعية الصبغ بالأسيتون وعرضها للموجات فوق الصوتونية لمدة 10 دقائق. أفرغ الأوعية ثم املأها مرة أخرى بالأسيتون. انتقل إلى إضافة كاشف sine إلى الأوعية ورجّها لمدة دقيقتين.

ثم قم بإخماد التفاعل بإضافة كمية كبيرة من الماء. بعد ذلك، جفف شرائح التغطية عن طريق تسخينها في الفرن عند 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحضير خليط PEG بتركيز حوالي 0.2% وزن/حجم من PEG المائي، مع العلم أن استخدام فاصل زجاجي لشرائح التغطية سيسمح بفصل الشرائح عن بعضها، ثم ضع 100 µL باستخدام الماصة على شريحة تغطية جافة ومُسيلنة.

ضع شريحة غطاء ثانية في الأعلى. قم بحضن شرائح الغطاء في محلول PEG لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، افصل كل زوج من شرائح الغطاء واغسلها جيداً بالماء.

احرص على إبقاء الجانب الموظيفي لشرائح الغطاء متجهاً للأعلى، حيث سيتم طلاء جانب واحد فقط بـ peg. أخيراً، قم بتجفيف شرائح الغطاء باستخدام الهواء المضغوط وتخزينها تحت تفريغ هوائي في مجفف، حيث تظل الأسطح مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل. وبذلك يمكن تحضير عشرات من شرائح الغطاء في دفعة واحدة واستخدامها حسب الحاجة.

بعد تجهيز شرائح التغطية، يمكن البدء في تجميع غرفة التدفق الخاصة بتجربة الجزيء الواحد. ابدأ بوضع 20 إلى 25 ملليلتر من محلول الحجب الذي يحتوي على BSA في مجفف لإزالة أي فقاعات هوائية لاستخدامها في الخطوات اللاحقة. بعد ذلك، قم بتخفيف 25 ميكرولتر من الستريبتوفيدين في 100 ميكرولتر من PBS ووزع المحلول على سطح شريحة تغطية وظيفية بـ peg، ثم حضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للستريبتوفيدين بالارتباط بالبيوتين الموجود على السطح أثناء تحضير الأجزاء الأخرى من الغرفة.

أثناء حضن غطاء الشريحة، قص قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه بحيث تطابق حجم شريحة الكوارتز المستخدمة لتجميع غرفة التدفق. حدد موقع ثقوب الأنابيب على الشريط باستخدام قلم رصاص بحيث يمكن رسم مخطط لغرفة التدفق على الشريط. بعد تحديد الثقوب، ارسم مستطيلاً بعرض 2 مليمتر حول العلامات.

سيكون هذا المستطيل بمثابة قناة التدفق، لذا تأكد من جعل الجوانب مستقيمة وترك مساحة حول مدخل ومخرج الأنابيب. الآن، قم بقص الشريط المحدد على طول المخطط المرسوم، مع إجراء قصات مستقيمة ونظيفة لضمان عدم بروز أي مادة لاصقة داخل القناة. نظف شريحة الكوارتز جيداً باستخدام الأسيتون لإزالة المادة اللاصقة الناتجة عن بناء خلية التدفق المستخدمة في التجارب السابقة.

حدد أفضل محاذاة لمخطط القناة. قم بإزالة أحد جانبي الغطاء اللاصق وضع الشريط بعناية على شريحة القشرة. احرص على محاذاة الشريط بشكل صحيح لضمان بقاء فتحات المداخل والمخارج غير مسدودة.

بعد ذلك، قم بتجهيز أطوال أنابيب مقطوعة بقطر 0.76 millimeter لكل من مدخل ومخرج خلية التدفق. يُفضل قطع نهاية الأنبوب بزاوية تبلغ حوالي 30 درجة لضمان عدم التصاق الأنبوب بشكل مسطح بأسفل الغرفة. قم بتعليق الأنابيب على حاملات أنابيب الاختبار لتسهيل توصيلها بخلية التدفق في الخطوات التالية.

بحلول الآن، تكون عملية تحضين غطاء الشريحة قد اكتملت. اشطف غطاء الشريحة المطلي بـ strep avid ENC جيداً بالماء وجففه باستخدام الهواء المضغوط. كن حريصاً على عدم قلب غطاء الشريحة لأن جانباً واحداً فقط هو الذي تم وظيفياً.

أخيراً، أكمل تجميع غرفة التدفق عن طريق إزالة الطرف الآخر من غطاء الشريط اللاصق ووضع شريحة الكوارتز فوق غطاء الشريحة. اضغط بخفة على غطاء الشريحة لطرد أي هواء محبوس في المادة اللاصقة؛ حيث يساعد ذلك في منع وصول أي فقاعات هوائية إلى قناة التدفق.

قم بسد جوانب الغرفة باستخدام الإيبوكسي. أدخل الأنابيب المقطوعة في فتحات الكوارتز وثبتها في مكانها باستخدام الإيبوكسي واتركها تجف لبضع دقائق. عندما يجف سداد الإيبوكسي، ابدأ بعملية حجب السطح.

باستخدام إبرة قياس 21، اسحب جزءاً من محلول التثبيت (blocking buffer) الخاص بـ Degas عبر أحد الأنابيب. قم بعملية الشطف عدة مرات لإزالة فقاعات الهواء، واترك الغرفة لتحضن لمدة نصف ساعة على الأقل قبل الانتقال إلى تجربة تضاعف الجزيء الواحد.

بعد سد خلية التدفق، ضعها على منصة المجهر. ثبّت الغرفة في مكانها باستخدام مشابك المنصة، وتأكد من محاذاة قناة التدفق على طول المحور y. قم بتوصيل أنبوب مخرج خلية التدفق بمضخة السرنجة باستخدام أنبوب توصيل ذي قطر أكبر.

ضع المدخل في محلول الحجز واسحب المكبس في المحقنة لإزالة أي هواء موجود في الأنبوب. سيساعد النقر الخفيف على أنبوب المخرج في تفريغ أي فقاعات هواء محاصرة في خلية التدفق. الآن أضف الـ DNA، حيث يتم تخفيف سلالة الـ DNA الأصلية لتصل إلى 25 picomolar في واحد milliliter من محلول الحجز، ثم اجعلها تتدفق إلى الغرفة بمعدل تدفق متوسط مثل 0.025 milliliters per minute لمدة 30 minutes للسماح بتغطية جيدة للسطح بواسطة الـ DNA.

بمجرد وجود DNA في الغرفة، اغسل الـ DNA الزائد باستخدام غسول المنظم الحاجب لـ 200 حجم خلية تدفق على الأقل. وللتخلص من جميع جزيئات DNA الحرة، قم بتشغيل الليزر والكاميرا. يجب أن يصل جهاز CCD المبرد إلى درجة الحرارة المطلوبة قبل أن يصبح قابلاً للاستخدام.

بعد غسل الحمض النووي (DNA) الزائد وإزالة الغازات من منظم التضاعف، قم بتحضير مزيج تفاعل التضاعف المكون من النوكليوتيدات وDTT والسيوتوكسين (cytoxin) ومنظم التضاعف. ثم أضف البروتينات واخلط المزيج برفق. بعد ذلك، قم بتمرير مزيج التفاعل إلى خلية التدفق.

يجب أن تكون سرعة التدفق هنا كافية لبسط الحمض النووي DNA مزدوج السلسلة؛ فبالنسبة لقناة تدفق بعرض 2 مليمتر وارتفاع 100 ميكرومتر، فإن معدل 0.04 ملليلتر في الدقيقة يعد مناسباً. اترك وقتاً كافياً لدخول الخليط إلى الغرفة، حوالي 10 دقائق.

حرك مجال الرؤية إلى جانب القناة وقم بضبط التركيز على المادة اللاصقة للتأكد من القرب من السطح لغرض التركيز وبدء التصوير. اضبط قدرة الليزر وتركيز المجهر وزاوية السطح. حافظ على قدرة منخفضة لتجنب أي انقسام ضوئي للحمض النووي المصبوغ DNA.

قم بالالتقاط بمعدل إطار واحد إلى خمسة إطارات في الثانية لعدة دقائق، اعتماداً على معدل تضاعف DNA. كرر العملية للحصول على مسارات تضاعف أطول، أو انتقل إلى حقل رؤية جديد لرؤية المزيد من الجزيئات عندما يتم ضخ معظم خليط التفاعل تقريباً داخل الخلية، مع تدفق المزيد من المنظم (buffer) مع cyt لرؤية حقول رؤية أخرى. يوفر التقاط صور متعددة لجزيئات مختلفة متضاعفة الإحصائيات اللازمة لتحديد الإنتاجية.

في اختبار تضاعف الدائرة المتدحرجة، يؤدي تخليق السلسلة الرائدة إلى تمديد الذيل الذي يربط الدائرة بالسطح، ثم يتم تحويل هذا الذيل إلى DNA مزدوج السلسلة بواسطة بوليميراز السلسلة المتأخرة، ويتم شده بواسطة التدفق الصفائحي الموضح. هذا مثال لمجال الرؤية باستخدام صبغة Cy3 عند إثارة بطول موجي 532 nanometer.

تمثل البقع الفلورية الصغيرة الركائز غير المنسخة والمقيدة. لاحظ الطول الشديد للنواتج والعدد الكبير من النواتج في كل مجال رؤية. سيظهر مجال الرؤية النموذجي العديد من الجزيئات التي تمر بعملية التضاعف، والتي تظهر كخطوط مضيئة متزايدة الطول من DNA المصبوغ. تعطي تجارب E Coli عند 37 °C من خمسة إلى 50 جزيئاً لكل مجال رؤية، اعتماداً على كثافة السطح.

تبدأ منطقة T7 repla بشكل أكثر كفاءة وستقوم بمضاعفة أكثر من 50% من الجزيئات في حقل الرؤية. ومع هذه الكثافة العالية، يصعب تمييز الجزيئات الفردية كما هو موضح هنا. لذا، قم بإجراء تجربة T7 بتركيزات بروتينية أقل أو كثافة سطحية أقل. تتضمن رسوم Chime البيانية للجزيئات النمطية التي تتضاعف في تجارب e coli وT7 مسارات النهاية للجزيئات من e coli وT7 مرسومة مقابل الزمن؛ وقد تم مواءمة المسارات باستخدام الانحدار الخطي للحصول على معدلات التضاعف، والتي تبلغ في هذا المثال 467.1 base pairs per second لـ e coli و99.4 base pairs per second لـ T7.

بالنسبة لـ T7، فإن توزيعات معدلات مسارات الجزيء الواحد التي تم مواءمتها باستخدام توزيعات غاوس المفردة أعطت متوسطاً قدره 535.5 ± 39 زوج قاعدي في الثانية لـ e coli و 75.9 ± 4.8 زوج قاعدي في الثانية. وبالنسبة لـ T7، تم مواءمة توزيعات أطوال نواتج التضاعف باستخدام اضمحلال أسي مفرد للحصول على الإنتاجية، والتي بلغت 85.3 ± 6.1 كيلو زوج قاعدي لـ e coli و 25.3 ± 1.7 كيلو زوج قاعدي لـ G7. وبذلك، نكون قد استعرضنا كيفية قياس تضاعف DNA المنسق باستخدام الجزيئات المفردة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تفعيل الأغطية الزجاجية (cover slips) بشكل صحيح وإنشاء قنوات تدفق مستقيمة ونظيفة. تأكد من الحفاظ على حمولة قدرة الليزر وتقليل التحلل الضوئي للحمض النووي DNA الطويل. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.