تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

في هذا الإجراء، يتم حقن نسخ من RNA المسمى بفلوروفورات في بويضات Xenopus laevis ومراقبة تموضعها. أولاً، يتم وسم RNA بنيوكليوتيدات فلورية.

في تفاعل نسخ في المختبر، يتم بعد ذلك تحميل الـ RNA في جهاز حقن مجهري. توضع البويضات في طبق حقن ويتم حقنها مجهرياً بعناية. وأخيراً، يتم استزراع البويضات للسماح بحدوث تموضع الـ RNA قبل التصوير باستخدام المجهر البؤري.

مرحباً، أنا جيمس غانيان من مختبر الدكتورة كيمبرلي مالوري في قسم البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية في جامعة براون. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير التموضع تحت الخلوي لـ RNA في بويضات *Xenopus*. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بنية RNA وعوامل البروتين المطلوبة لتموضع RNA خلال المراحل المبكرة من تطور الفقاريات.

فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بنسخ mRNA، بحيث يكون مُعلمًا إشعاعيًا وفلوروسنتياً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. أضف DNase لتحليل DNA القالب، ثم أوقف التفاعل بإضافة EDTA.

قم بإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة الأخرى عن طريق الطرد المركزي عبر عمود G 50. بعد ذلك، يتم تركيز الـ RNA عن طريق الترسيب بالإيثانول، ثم غسله وإعادة تعليقه. بعد تحديد التركيز بواسطة العد الومضي، خفف الـ RNA إلى 50 nano molar وخزنه في حصص مقدار كل منها 5 µL عند درجة حرارة -80 °C.

عند الاستعداد لإجراء الحقن المجهري، يتم إذابة كمية من الـ RNA الموُسم وتسخينها لفك الارتباط عند 70 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الجسيمات، ثم تُحفظ على الثلج. بعد ذلك، يتم عزل الخلايا عن طريق تقطيع أجزاء من مبيض *Xenopus laevis* في أنبوب مخروطي سعة 50 mL يحتوي على 25 mL من محلول بتركيز 3 mg/mL.

كولاجيناز (Collagenase) في محلول فوسفات البوتاسيوم المنظم بتركيز 0.1 مولار عند pH 7.4. يُرج بلطف عند 18 درجة مئوية نظرًا للاختلافات بين الدفعات. قد تختلف مدة المعالجة بالكولاجيناز ويجب مراقبتها بعناية من خلال الفحص البصري.

لضمان إزالة الأغشية المحيطة، استمر في الرج لمدة 15 دقيقة أو حتى تنفصل البويضات بشكل مرئي عن المبيض، ثم اترك البويضات تترسب في قاع الأنبوب المخروطي. تخلص من المحلول واستبدله بمحلول MBSH المنظم. كرر هذه الخطوة، واغسل مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.

بعد ذلك، قم بفرز الخلايا الجرثومية (CYTES) في المرحلتين الثالثة والرابعة يدويًا في محلول MBSH المنظم باستخدام مجهر ضوئي قياسي. تكون الخلايا في المرحلة الثالثة معتمة تمامًا ولكنها بيضاء، بينما تكون الخلايا في المرحلة الرابعة أكبر قليلاً ومنقطة بالصبغة.

تكون الخلايا التي تتسم بشفافية طفيفة صغيرة جداً في السن، بينما تكون الخلايا ذات التصبغ الكامل أو التي تظهر توزيعاً مستقطباً للصبغة مسنة جداً. وأخيراً، قم بتجهيز الإبر المستخدمة في الحقن المجهري باستخدام شعيرات شعرية بطول ثلاثة ونصف بوصة، مع السحب والصقل لصنع إبر بقطر خارجي يبلغ 0.05 millimeters تقريباً. والآن بعد أن أصبحت الخلايا البيضية وmRNA والإبر جاهزة، انتقل إلى عملية الحقن المجهري.

ابدأ بمعايرة الإبرة باستخدام ماء منزوع الأيونات لضخ 2 nanometers في كل عملية حقن. قم بتعبئة الإبرة باستخدام حقن مجهري يتم التحكم فيه بالغاز، وعاير حجم القطرة باستخدام الميكرومتر؛ وبعد المعايرة، قم بتعبئة الـ RNA المراد حقنه في الإبرة. بعد ذلك، ضع البويضات المفروزة في طبق حقن يحتوي على محلول MBSH المنظم، مع العلم أن الطبق يحتوي على طبقة من المطاط الرغوي الأسود.

تظهر البويضات البيضاء بوضوح مقابل خلفية سوداء. بعد ذلك، قم بحقن كل بويضة بعناية بـ 2 µL من الـ RNA بتركيز 50 nM. تأكد من حقن كل بويضة مرة واحدة فقط، وافحص الإبرة بانتظام للتأكد من عدم انسدادها عند اكتمال عملية الحقن.

تخلص من الحمض النووي الريبي (RNA) المتبقي، واشطف الإبرة بماء منزوع الأيونات ثم قم بتحميل الـ RNA التالي للحقن. بعد الحقن، انقل الخلايا المحقونة إلى بئر في طبق معقم يحتوي على 24 بئراً، حيث يمكن زراعة ما يصل إلى ألف خلية في البئر الواحد.

قم بإزالة المحلول المنظم واستبداله بـ 400 µL من وسط زراعة الخلايا (cyte culture medium) لكل بئر. بعد ذلك، ضع طبق الزراعة داخل حاوية بلاستيكية تحتوي على منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة أثناء الزراعة، واحضن البويضات عند 18 °C لفترات زمنية تتراوح بين 8 و48 ساعة بعد فترة الحضن المطلوبة. يمكن تجهيز البويضات للفحص المجهري بعد حضن البويضات المحقونة.

استبعد أي بويضات ميتة وضع البويضات الناجية في قوارير زجاجية. ويُلاحظ روتينيًا بقاء أكثر من 90% من البويضات على قيد الحياة. استبدل المحلول المنظم بمثبت M-E-M-F-A وقم بهز الخلايا لمدة 20 دقيقة.

احمِ البويضات من ضوء الشمس أثناء عملية التثبيت بعد اكتمال فترة التثبيت. اغسل البويضات عن طريق إزالة المثبت واستبداله بحجم مساوٍ من محلول MBSH المنظم. كرر عملية الغسل هذه مرة أخرى ليصبح المجموع غسلتين.

بعد ذلك، اغسل البويضات في ميثانول لامائي. أولاً، قم بإزالة نصف الحجم واستبدله بالميثانول. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين.

بعد عمليات الغسل هذه، قم بإزالة المحلول بالكامل واستبدله بالميثانول. كرر عملية الغسل بالميثانول هذه مرة أخرى. يمكن تخزين البويضات المثبتة والمجففة عند درجة حرارة -20 °C حتى يحين وقت التصوير.

قبل التصوير، أضف وسط ماري للتصفية (Marie's clearing medium) إلى طبق WPI fluoro ذو قاعدة زجاجية لتغطية سطح التصوير. انقل البويضات بعناية من الميثانول إلى طبق fluoro، مع تقليل حجم الميثانول المنقول إلى أدنى حد، ثم قم بتصوير البويضات باستخدام مجهر كونفوكالي مقلوب؛ حيث يعطي كل من Zeiss LSM 510 و aica TCS SP نتائج جيدة. سنعرض الآن بعض الصور التمثيلية لتمركز الحمض الريبوزي النووي (RNA) تحت الخلوي مباشرة بعد الحقن المجهري؛ حيث يمكن رؤية الـ RNA الفلوري في النواة بعد ثماني ساعات من زراعة العينة الضابطة الموُسمة فلورياً.

يمكن رؤية الـ RNA موزَّعاً بشكل منتظم في سيتوبلازم البويضة. ومع ذلك، يمكن رؤية الـ RNA المسمى بفلوروكروفور، والذي يحتوي على تسلسلات تستقطب آلية النقل، وهو في عملية التموضع تحت الخلوي باتجاه القطب الخضري للبويضة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية الحقن المجهري لـ RNAs مسمى بفلوروكروفور في البويضات ومراقبة تموضع الـ RNA بواسطة المجهر البؤري.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام محلول معالج بـ DEPC لتجنب تلوث الرنا (RNAs) في المزرعة، وزراعة الخلايا البيضية في وسط OCM يحتوي على مضادات حيوية، وحماية الخلايا البيضية من ضوء الشمس قدر الإمكان لتجنب التبييض الضوئي. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.