إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

الهدف من التجربة التالية هو تسجيل العمليات الديناميكية في مواقع U الحية في ذبابة الفاكهة drosophila. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل مبايض سليمة من ذبابات إناث عمرها يومان وتغذيتها جيداً. وكخطوة ثانية، يتم استخراج القنوات الفردية من المبايض لتصوير غرف البيض.

وبعد ذلك، إذا كانت تعبر عن بروتين فلوري مناسب، يمكن تصوير غرف البيض الفردية مباشرة أو إخضاعها لمزيد من المعالجات، مثل الحقن المجهري لعلامات فلورية قبل التصوير. وفي النهاية، ومن خلال تحليل تتابعات الفيديو، يمكن الكشف عن التفاعل الديناميكي للمكونات داخل الخلوية. وقد ساعدتنا هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال نقل RNA والترجمة الموضعية.

على سبيل المثال، كيف يتم تنظيم تعبير البروتينات التي تحدد مخطط الجسم زمنياً ومكانياً في الكائن الحي؟ وبشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأنها تتطلب سرعة ومهارةهاً كبيرة. ويمكن تحقيق نتائج أفضل من خلال الممارسة المستمرة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن عمليات مناولة غرف البيض يصعب نقلها عبر النصوص ولأنها تتطلب خبرة فنية وصبرًا وثباتًا في اليدين. ابدأ هذا الإجراء بوضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون على شريحة غطاء وضعها جانباً. ثم قم بتخدير الذباب المجهز باستخدام ثاني أكسيد الكربون.

استخدم ملقطًا دقيقًا حاد الرأس للإمساك بذبابة أنثى سمينة من المنطقة الأمامية للبطن. تجنب الإمساك بها من منتصف البطن. أمسك الأنثى على ارتفاع يتراوح بين سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تقريبًا فوق غطاء الشريحة المجهز.

باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط، قم بإزالة الأنسجة الموجودة في الطرف الخلفي الأقصى للأنثى. وعادةً ما يشمل ذلك أنسجة الأمعاء باستخدام ملاقط نظيفة. قم بتدليك البطن برفق من الطرف الأمامي إلى الطرف الخلفي، تماماً مثل عصر معجون الأسنان من الأنبوب.

تبدو المبيضات كبنى معتمة كبيرة وستلتصق بطرف الملقط. اجمع المبيضات عن طريق لمسها لزيت الكربون الهالو (halo carbon oil) الموجود على الشريحة. ثم كرر العملية حتى يتم جمع من أربعة إلى ستة مبيضات.

قبل عزل الهوائيات، اضبط مصدر الضوء في المجهر بحيث يسقط الإضاءة على الشريحة بزاوية ضحلة، مما يؤدي إلى تكوين ظلال متباينة على الأنسجة. عند تشريح الذباب، من المهم جداً استخدام الأدوات المناسبة.

إن المؤشر الذي نستخدمه ليس حادًا جدًا لكي لا يتلف النسيج، بل هو ثلم إلى حد ما لنتمكن من الإمساك بالملقط الذي نستخدمه. ومرة أخرى، لا يكون الملقط حادًا جدًا لكي لا يتلف الأنسجة، ولكن يكون حادًا بما يكفي لتمكيننا من تحريك الأشياء دون ثني الأداة. ومن المهم جدًا أيضًا أن تكون الأدوات نظيفة، لذا نقوم بتنظيفها بانتظام طوال الإجراء باستخدام ملقط مغلق.

افصل المبيضين عن طريق إزالة النسيج الضام عند الطرف الخلفي. يحتوي الطرف الخلفي على أكثر حجرات البيض نضجاً. وجِّه المبيض أفقياً بحيث تكون حجرات البيض الأصغر سناً باتجاه يدك المهيمنة.

بعد ذلك، أمسك الطرف الخلفي برفق من خلال النسيج الضام المتبقي، واستخدم مسبار تشريح أو إبرة تنجستن لفصل غرف البيض الفردية؛ حيث ستنفصل غرف البيض من مرحلة Jamar حتى المرحلة 10 عن بعضها البعض، بينما تظل غرف البيض الأقدم متصلة بالمبيض. وبواسطة المسبار، اسحب بعناية من 15 إلى 25 من هذه الغرف المنفصلة إلى مركز قطرة الزيت. في حال كانت هناك حاجة لتشريح أكثر من مبيض واحد، اختر مبيضاً من ذبابة أخرى.

تخلص من أي أنسجة مبيض زائدة واعمل بسرعة لأن الخلايا ستبدأ في إظهار تغيرات نمطية نتيجة للإجهاد. بعد مرور 40 دقيقة من التشريح من المبيض، قم بإزالة أنسجة المبيض الزائدة من الزيت. باستخدام أدوات نظيفة لحقن الخلايا في المرحلة المتوسطة، وجه الهوائيات بشكل عمودي على المحور الطولي لغطاء الشريحة. لعزل غرف البيض في المرحلة المتأخرة.

تتطلب العملية اتباع طريقة مختلفة عند الإمساك بالجزء الخلفي من المبيض كما تم وصفه سابقاً. أدخل مسبار التشريح في الطرف الخلفي للمبيض بالقرب من الملقط. ولتجنب ثقب غرف البيض، أدخل المسبار بين غرف البيض في مراحلها المتأخرة.

اسحب إبرة التشريح عبر المبيض حتى تخرج عند غرف البيض في المرحلة المبكرة. عند تنفيذ ذلك بشكل صحيح، سيزيل المسبار النسيج الضام الذي يثبت الأريولات وغرف البيض في المرحلة المتأخرة في مكانها. كرر هذه الخطوة حتى تنتشر الأريولات على شريحة الغطاء.

تكتمل هذه الخطوة عندما لا تعود غرف البيض متراكمة فوق بعضها البعض. باستخدام مسبار التشريح، افصل غرف البيض في المراحل المتأخرة لتسهيل التصوير من أجل تحديد موضع المرحلة 14. استخدم الملاقط للإمساك بالزوائد الظهرية لغرف الرقبة.

قم بتحضير المحاليل المراد حقنها عن طريق إجراء عملية طرد مركزي قصيرة بسرعة عالية. سيؤدي ذلك إلى تجميع أي رواسب صلبة قد تسد إبرة الحقن. بعد ذلك، قم بتعبئة إبرة الحقن باستخدام طرف تعبئة، ثم قم بتثبيت إبرة الحقن المعبأة بعناية في الجهاز الحقن.

ضع الآن قطعة صغيرة من الزجاج بجانب العينات وثبّت الشريحة على منصة المجهر. ستعمل قطعة الزجاج كحاجز لكسر أو فك الارتباط. افصل الإبرة.

قم بتجهيز المجهر وجهاز الحقن من أجل التجربة، مع الحرص على عدم كسر طرف الإبرة. إذا كان ذلك ممكناً، استخدم منصة آلية تتميز بخاصية زيارة النقاط (point visiting capability) لتحديد جميع الخلايا في المرحلة الثامنة والمرحلة التاسعة والمعدة للحقن.

الآن، اخفض إبرة الحقن حتى تلامس الزيت. اختر النقطة الأولى من قائمة النقاط المحددة وقم بتركيز الرؤية على الخلية. اخفض الإبرة يدويًا حتى تصبح في نفس مستوى بؤرة التركيز الخاصة بالخلية.

باستخدام أدوات التحكم في المانيبولاتور، حرك رأس إبرة الحقن حتى تصبح داخل الموقع U. غالباً ما تكون حركة الطعن السريعة أكثر نجاحاً من الحركة البطيئة. وبمجرد الدخول، احقن حجماً صغيراً من الإبرة وقم بتقييم التأثيرات بصرياً.

يجب تكرار العملية. إذا تم الحقن بنجاح، فسيتم إزاحة السيتوبلازم الموجود داخل الخلية. ومن الصعب تحديد الكمية الدقيقة للسائل المحقون.

لزيادة الحجم المحقون، قم بتعديل الضغط أو مدة نبضة الحقن. اكسر طرف الإبرة لزيادة فتحة الإبرة قليلاً، أو ببساطة استخدم نبضات حقن متعددة قبل اختيار خلية Mark.Cyte التالية. ارفع إبرة الحقن بما يكفي في الزيت بحيث لا تصطدم بالخلايا الأخرى.

إن الوخز المتكرر أو ترك الإبرة لفترة طويلة داخل الخلية يتسبب في ضرر جسيم لحجرة البيضة. لذا يجب العمل بسرعة، حيث يجب أن تستغرق عملية الحقن أقل من 10 ثوانٍ.

في حال حدوث خطأ، انتقل إلى العلامة التالية في الموقع. لا تضيع الوقت في المواقع التالفة. وعندما تنسد الإبرة، انقلها إلى قطعة الزجاج المكسورة.

مع وجود الزجاج والإبرة في نفس المستوى البؤري، ادفع الإبرة برفق داخل الزجاج. تأكد من أن الإبرة غير مسدودة عن طريق الضغط على زر الحقن وملاحظة ما إذا كان هناك أي سائل يخرج من طرف الإبرة. عند الانتهاء من الحقن في جميع مواقع الموجات فوق الصوتية، حرك الإبرة يدويًا خارج الزيت ووجهها بعيدًا عن مسار شعاع المجهر.

تأكد من وضعها في اتجاه آمن لتجنب تلف العين، مع إطفاء الأنوار. ويعد تسريع عملية التصوير الفلوري أمراً ضرورياً. إذا مضت ساعة أو أكثر بين عزل حجرة البيضة وحقن الخلايا، فسيصعب حقن الخلايا وستظهر عليها تغيرات نمطية مرتبطة بالإجهاد.

يمكن أن تنشأ مشكلات مماثلة نتيجة التعامل العنيف مع الخلايا أو حقن أحجام زائدة. ويمكن تصوير غرف البيض التي تعبر عن بروتينات فلورية معدلة وراثياً دون الحاجة إلى الحقن. كما يمكن تصوير وسم MS two للـ RNA الداخلي بنتائج جيدة باستخدام إجراءات عزل الأنسجة المتبعة في الإجراء الكامل للتخليق المختبري.

تم حقن RNA من نوع Alexa, 5 46 kin في غرفة بيض ME 31 BGFP، حيث تمركز الـ RNA في المنطقة الظهرية الأمامية من الخلية وشكل غطاءً حول النواة. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 10 دقائق تقريبًا من وقت التشريح وحتى بدء التصوير. عند محاولة إجراء هذه العملية، يرجى مراعاة سلامة الأنسجة من خلال العمل بسرعة ولكن بدقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل العمليات الديناميكية في خلايا Drosophila الحية.