تحليل شامل للالتركيبية جدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الأول : اللجنين

يبدأ تحديد محتوى اللجنين وتركيبه في جدران الخلايا النباتية باستخدام مادة نباتية مجففة، والتي تخضع لعمليات استخلاص متنوعة. تتكون المادة الناتجة من جدران الخلايا فقط، ثم يتم تقسيمها لتحديد محتوى اللجنين. وتخضع مادة الجدار للتحلل المائي بواسطة بروميد الأسيتيل، ثم يتم قياس كمية المونومرات الذائبة باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية لتحديد تركيب اللجنين.

تتحلل مادة الجدار عن طريق التحلل الخلوي. ثم تُشتق مكونات اللجنين المذابة إلى مشتقات ثلاثي ميثيل سيليل الفولتيلية، والتي يمكن فصلها وتقديرها كمياً باستخدام كروماتوغرافيا الغاز بالتزامن مع مطيافية الكتلة. ويتم توضيح تحديد تركيب السكريات المتعددة في المصفوفة ومحتوى السليلوز في فيديو آخر بعنوان Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.

مرحبًا، أنا ماركوس بولي، رئيس مرفق تحليل الجدران الخلوية في مركز بحوث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى هنا في جامعة ولاية ميشيغان. وأنا كليف فوستر، مدير مرفق تحليل الجدران الخلوية. سنعرض لكم الإجراء المتبع لتحديد محتوى وتكوين عينات الكتلة الحيوية النباتية.

تقوم النباتات بتحويل الطاقة الضوئية من الشمس إلى طاقة كيميائية مثل الكتلة الحيوية. تتكون الكتلة الحيوية النباتية بشكل أساسي من الجدران الخلوية، وهي شبكة معقدة من مجموعة متنوعة من البوليمرات التي تغلف جميع الخلايا النباتية. نقوم هنا بتحديد تركيب مواد الجدار الخلوي النباتي لتقييم إمكانية تحويل هذه lignin Cellose X، والتي تعد مورداً متجدداً وفيرًا للغاية، إلى وقود حيوي.

سنتناول اليوم مادة اللجنين البوليفينولية في مقطع فيديو آخر بعنوان "التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية، الجزء الثاني: الكربوهيدرات". وسنركز على تحليل السكريات المتعددة. لبدء هذا الإجراء، أضف ثلاث كرات من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 5.5 millimeter إلى أنبوب سعة 2 milliliter ذي غطاء لولبي، وأضف ما يقرب من 60 to 70 milligrams من المادة النباتية المجففة بالهواء أو بالتجميد.

يمكن طحن المادة لتحويلها إلى مسحوق ناعم باستخدام eyewall، وهو روبوت للطحن والتوزيع. يقوم eyewall بأخذ الأنبوب ورجه لمدة 30 ثانية، حيث يتم طحن المادة إلى مسحوق ناعم بفضل الكرات المعدنية، ثم يتم تفكيك مسحوق النبات المطحون والمكتنز عبر إجراء بديل غير روبوتي منخفض الإنتاجية. يتم عرض تسهيل عملية الاستخلاص في الجزء الثاني، حيث يتم إضافة 1.5 M من الإيثانول المائي بتركيز 70% إلى المادة المطحونة، ثم تُخلط جيداً باستخدام جهاز vortex وتُفصل بجهاز الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.

تؤدي هذه المعالجة إلى إذابة معظم البروتينات وعضيات الخلية؛ لذا يتم سحب الطافي وإضافة محلول كلوروفورم ميثانول بنسبة حجم إلى حجم. يتم رج الراسبة غير القابلة للذوبان في الكحول جيداً ثم إعادة تدويرها وطردها مركزياً. يقوم الكلوروفورم ميثانول باستخلاص المركبات الكارهة للماء مثل الدهون، وبعد الطرد المركزي، يتم سحب الطافي وإعادة تعليق الراسبة في 500 microliters من الأسيتون.

لتجفيف العينة، قم بتبخير المذيب باستخدام تيار هوائي عند 35 °C حتى الجفاف، ويمكن تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة حتى تتم معالجتها لاحقاً. ولبدء عملية إزالة النشا من بقايا العينة، قم بتعليق الراسب في 1.5 mL من خلات الصوديوم بتركيز 0.1 M ورقم هيدروجيني pH 5، ثم أغلق الأنابيب بإحكام وسخنها في وحدة التسخين (heating block) لجلتنة النشا. وبعد تبريد المعلق على الثلج، أضف مزيج الإنزيمات المفككة للنشا، وأغلق الأنبوب وقم برجّه جيداً باستخدام جهاز الفورتكس (vortex)، ثم حضّن المعلق طوال الليل.

في جهاز الرج بداخل درجة حرارة 37 درجة مئوية، يضمن جهاز الرج الدوار عملية الخلط المناسبة. وبعد فترة الحضن طوال الليل، يتم إيقاف عملية الهضم عن طريق التسخين في كتلة تسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم إجراء عملية الطرد المركزي والتخلص من الطافي، الذي يحتوي على النشا الذائب.

اغسل الراسب المتبقي ثلاث مرات باستخدام 1.5 mils من الماء في كل مرة عن طريق المزج الدوامي، والطرد المركزي، والصب كما تم توضيحه سابقاً. أخيراً، أعد تعليق الراسب في 500 microliters من الأسيتون وبخّر المذيب بتيار هوائي عند 35 degrees Celsius حتى يجف. تصبح العينات المجففة التي تحتوي على جدار الخلية المعزول أو leg, no celluloses جاهزة لمزيد من التحليل ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.

ابدأ بوزن 1 إلى 1.5 مليجرام من مادة جدار الخلية المُحضرة. يمكن وزن المادة يدويًا أو بطريقة آلية باستخدام جدار العين كما هو موضح في الجزء الثاني. اشطف جدران الأنبوب بـ 250 µL من الأسيتون لتجميع مادة جدار الخلية في قاع الأنبوب، ثم بخر الأسيتون بلطف شديد تحت تدفق هوائي.

بعد تبخر الأسيتون، أضف برفق 100 µL من بروميد الأسيتيل بتركيز 25% (حجم/حجم) المحضر حديثاً في حمض الأسيتيك الثلجي على طول الجدارين. لمنع التطاير، يعمل البروميد بشكل طفيف على تفكيك بوليمر اللجنين إلى أحاديات سكر مُسيتلتة. بعد ذلك، قم بسد الدورق الحجمي وسخنه عند 50 °C لمدة ساعتين.

سخن لمدة ساعة إضافية مع الرج كل 15 دقيقة، ثم برد أخيراً على الثلج. بعد تبريد القارورة في درجة حرارة الغرفة، أضف 400 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 M و 70 µL من هيدروكلوريد الهيدروكسيلامين بتركيز 0.5 M المحضر حديثاً، ثم قم برج القوارير الحجمية باستخدام جهاز vortex. بعد ذلك، قم بمعادلة المحلول عن طريق ملء القارورة الحجمية بدقة حتى علامة 2 mL باستخدام حمض الخليك الثلجي، ثم أغلق القارورة واقلبها عدة مرات للمزج. انقل بواسطة الماصة 200 µL من المحلول الذي يحتوي على mono lals المحللة والمذابة إلى لوح 96 well مخصص للأشعة فوق البنفسجية (UV)، واقرأ اللوح باستخدام قارئ الألواح عند 280 nm. اقرأ اللوح ثلاث مرات على الأقل واحسب متوسط الامتصاصية، حيث يمكن أن تسبب الجزيئات العالقة تبايناً طفيفاً في قيم الامتصاصية.

قم بتحديد النسبة المئوية لللجنين القابل للذوبان في البروميد (BSL) باستخدام معامل النبات المناسب وفقاً للمعادلة الموضحة في البروتوكول المكتوب. يُعد اللجنين شبكة من البوليفينول تتكون أساساً من ثلاث وحدات فرعية، وهي وحدات p-hydroxyphenyl وguaiacyl وsyringyl، وذلك لتحديد تركيب اللجنين في المادة النباتية. ابدأ بنقل حوالي 2 mg من مادة الجدار الخلوي إلى أنبوب زجاجي ذو غطاء لولبي لإجراء عملية التحلل الخلوي.

بعد ذلك، استعد لتحضير محلول boron tri fluoride ethyl ate بتركيز 2.5%، ومحلول ethane thiol بتركيز 10% في dioxane. وبما أن dioxane مادة خطيرة للغاية، فلا تخرج أي عينات أو معدات من خزانة استرداد الغازات (the hood). تذكر أن تعمل بحذر شديد واستخدم بالوناً مملوءاً بغاز النيتروجين لإزاحة الحجم المفقود في زجاجة dioxane بالنيتروجين.

قم بتحضير المحلول عن طريق خلط الأحجام التالية لكل عينة: 175 µL من dioxane و20 µL من ETSH و5 µL من BF3. بعد الخلط، أضف 200 µL من المحلول إلى كل عينة. قم بتطهير الحيز العلوي للقارورة بغاز النيتروجين ثم أحكم إغلاقها.

باشر فوراً بتسخين العينات عند 100 °C لمدة أربع ساعات مع الخلط اللطيف عند نهاية كل ساعة. أوقف تفاعل التحلل بوضع العينات على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 150 µL من بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.4 molar للمعادلة ثم استخدم جهاز الـ vortex.

لتنقية نواتج تفكك اللجنين، أضف 1 مل من الماء و0.5 مل من الأسيتات، ثم استخدم جهاز الفورتيكس (vortex) واترك الأطوار لتنفصل. ستكون طبقة أسيتات الإيثيل في الأعلى وطبقة الماء في الأسفل. انقُل 150 µL من طبقة أسيتات الإيثيل العلوية التي تحتوي على مكونات اللجنين إلى أنبوب سعة 2 مل، مع التأكد من عدم نقل أي كمية من الماء.

بعد النقل من طبقة خلات الإيثيل العلوية، قم بتبخير المذيب باستخدام جهاز تركيز بالهواء. أضف 200 µL من الأسيتون ثم قم بالتبخير. كرر المعالجة بالأسيتون مرتين لإزالة الماء الزائد.

للاشتقاق التالي لمكونات اللجنين إلى مشتقات trimethyl silyl المتطايرة، أضف 500 µL من ethyl acetate، و 20 µL من purine، و 100 µL من BSTFA إلى كل أنبوب. قم بالتحضين لمدة ساعتين عند 25 °C.

في نهاية الساعتين، انقل 100 µL من التفاعل إلى قارورة GC MS وأضف 100 µL من الأسيتون. حلل العينات باستخدام GC مجهز بمطياف كتلة رباعي أو كاشف تأين اللهب. للحصول على تفاصيل العمود وظروف التشغيل، يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق.

فيما يلي بعض النتائج التمثيلية لتحليل اللجنين باستخدام خشب الحور كمادة نباتية. ووفقاً لهذا التحليل، فإن 22% من مادة الحور تتكون من لجنين البوليفينول. وقد تم تحليل تركيب مكونات اللجنين بواسطة GCMS.

يتم تحديد القمم من خلال أزمنة الاستبقاء النسبية باستخدام معيار داخلي من tetra coane أو من خلال أيونات طيف الكتلة المميزة 2 99 MZ و 2 69 MZ و 2 39 MZ لمونومرات sg و h على التوالي. يتم تقدير كمية مكونات اللجنين من خلال تعيين إجمالي مساحة القمة بنسبة 100%. يظهر تحليل التركيب أن هذه العينة المحددة تحتوي بشكل أساسي على وحدات string أو S. ومع ذلك، فإن وحدات Goya أو aol أو G وفيرة أيضاً.

من الواضح أن الكمية وتكوين الوحدات الأحادية يمكن أن تختلف اعتماداً على نسيج النبات ونوعه. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تحديد محتوى اللجنين وتكوينه في المادة النباتية من أجل تحليل السكريات المتعددة. انتقلوا إلى الجزء الثاني.

شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.