التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

يبدأ تحديد تركيب السكريات المتعددة للمصفوفة ومحتوى السليلوز المتبلور في جدران الخلايا النباتية باستخدام مواد نباتية مجففة، والتي تخضع لعمليات استخلاص متنوعة. وتتكون المادة الناتجة من جدران الخلايا فقط، ثم يتم تقسيمها لتحديد تركيب السكريات المتعددة للمصفوفة. وتُعالج مادة الجدار بحمض ضعيف لتمييه السكريات المتعددة غير المتبلورة، والتي تكون بشكل أساسي السليلوزات الهيمية، إلى سكرياتها الأحادية.

يتم بعد ذلك تحويل السكريات الأحادية إلى أسيتات ألدول المتطايرة المقابلة لها، والتي يتم تحليلها وقياس كميتها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز المقترنة بمطياف الكتلة لتحديد السليلوز المتبلور. تُعالج جدران المحتوى بالكاشف الرسومي، وهو خليط من الأحماض التي تزيل مكونات الجدار غير المتبلورة. أما السليلوز المتبلور المتبقي فيتحلل إلى مونومر الجلوكوز الخاص به، والذي يمكن تحليله عن طريق القياس الكولوريمتري.

يتم توضيح كيفية تحديد محتوى اللجنين وتركيبه في منشور فيديو آخر من JoVE بعنوان التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية، الجزء الأول: اللجنين. مرحبًا، أنا ماركوس بولي، رئيس مرفق تحليل الجدران في مركز بحوث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى هنا في جامعة ولاية ميشيغان. أنا كليف فوستر، مدير مرفق تحليل جدار الخلية.

سنوضح لكم اليوم كيفية تحديد تركيب السكريات المتعددة الموجودة في مادة جدار الخلية النباتية، والتي تشمل السليلوز وأنواع مختلفة من الهيميسليلوز. نقوم هنا في مركز بحوث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى بتطوير تكنولوجيا لتحويل هذه السكريات إلى وقود حيوي. ومن أجل تحديد المادة الخام النباتية المثلى، نحتاج أولاً إلى تقييم نوع ووفرة السكريات الموجودة في هذه الكتلة الحيوية.

في فيديو آخر بعنوان "التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية، الجزء الأول: اللجنين"، سنركز على تحليل البوليفينول. لذا، لنبدأ. ابدأ هذا الإجراء بعزل جدران الخلايا.

اطحن ما يقرب من 60 إلى 70 مليغرام من المادة النباتية المجففة باستخدام كرات من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 5.5 مليمتر في أنبوب SAR TED ذو غطاء لولبي وسعة 2 مل. كبديل عالي الإنتاجية، استخدم مطحنة REM مع روبوت للطحن والتوزيع يسمى eyewall كما هو موضح في الجزء الأول. عند اكتمال عملية الطحن، قم بإزالة الكرات الفولاذية.

استمر في عزل جدران الخلايا وإزالة النشا المتبقي كما هو موضح في الجزء الأول وموصوف في البروتوكول المكتوب المرفق. قم بوزن 2 mg من مادة جدار خلية نشا DS في أنبوب سارد سعة 2 ml. وتعد روبوت eyewall وسيلة عالية الإنتاجية لأداء هذه المهمة.

يقوم الروبوت بأخذ أنبوب يحتوي على مادة نباتية مطحونة ويثقب فتحة في قاع الأنبوب. ثم يُوضع الأنبوب المثقوب على مغذٍّ من نوع VI. يوضع أنبوب فارغ على ميزان ويُزاح تحت مغذٍّ VI، ومن خلال الاهتزاز تترشح المادة عبر الثقب الموجود في الأنبوب العلوي المشحون إلى الأنبوب السفلي الفارغ حتى تتراكم الكمية المطلوبة من المادة.

أضف 100 micrograms من acetol كمعيار داخلي. اشطف جدران الأنبوب باستخدام acetone لتجميع مادة جدار الخلية في قاع الأنبوب، ثم بخر acetone برفق شديد تحت تدفق هوائي. بعد ذلك، قم بإجراء التحلل المائي باستخدام حمض ضعيف.

أضف بعناية 250 µL من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك بتركيز 2 M أو TFA إلى كل عينة، مع التأكد من عدم تطاير أي مادة على جدران الأنبوب. أغلق الأنابيب بإحكام وحضنها عند 121 °C في قالب تسخين لمدة 90 دقيقة. ثم برد قوالب التسخين والعينات على الثلج، وقم بإجراء طرد مركزي للأنابيب بسرعة 10,000 RPM لمدة 10 دقائق.

انقل 100 µL من الطافي الحمضي الذي يحتوي على السكريات المذابة من عديد السكاريد للمصفوفة إلى أنابيب ذات أغطية لولبية، مع الحرص على عدم تعكير مادة الراسب. يمكن استخدام الراسب في مقايسة السليلوز المتبلور. قم بتبخير TFA في أنبوب زجاجي تحت تيار هواء خفيف باستخدام جهاز تبخير.

أضف 300 µL من البروبانول الثنائي لإزالة الحمض الزائد، ثم استخدم جهاز الرج (vortex) والتبخير عند 25 °C. كرر هذه العملية لثلاث مرات إجمالاً. ومن أجل تمكين تحديد السكريات الأحادية بواسطة الكروماتوغرافيا الغازية، قم بإجراء عملية اشتقاق الأسيتات الألدولية.

أولاً، يتم اختزال السكريات الأحادية إلى الألدولات ذات الحلقة المفتوحة المقابلة لها، ثم تُنقل إلى مرحلة الأستلة. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تعليمات مفصلة. تتبع كل خطوة من الإجراء البروتوكول الموضح سابقاً: إضافة الكاشف، والتحضين، والتبخير تحت تيار هوائي، يليه إزالة الكاشف الزائد من خلال خطوات غسيل متنوعة.

في الخطوات النهائية، يتم استخلاص أسيتات الألدول. أولاً، أضف 500 µL من إيثيل الأسيتات ورُج الأنبوب بلطف. ثم أضف 2 mL من الماء، وأغلق الأنابيب بإحكام وقم برجها بجهاز vortex، ثم قم بطرد مركزي للأنابيب بسرعة 2000 RPM لمدة خمس دقائق للحصول على طبقات منفصلة وواضحة تكون فيها طبقة إيثيل الأسيتات في الأعلى وتحتوي على أسيتات الألدول والماء في الأسفل. اسحب بواسطة الماصة 50 µL من طبقة إيثيل الأسيتات وانقلها إلى قوارير GCMS المزودة بإدخالات، ثم خفف العينة بإضافة 100 µL من الأسيتون إلى قارورة GC، ويمكن تخزين قارورة GC عند درجة حرارة 4 °C.

إذا لم يتم البدء في تحليل GCMS على الفور، فقم بحقن العينات في جهاز كروماتوغرافيا غازية مجهز بمطياف كتلة رباعي القطب. للحصول على تفاصيل العمود والتشغيل، يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق. يمكن أن تكون المادة البادئة لتحديد محتوى السليلوز البلوري عبارة عن مادة جدار خلوي معزولة أو مادة جدارية تمت معالجتها بالفعل بحمض TFA الضعيف، سواء تم ذلك فوراً بعد المعالجة الحمضية أو في شكل مجفف قابل للتخزين.

بعد إزالة فائض TFA باستخدام iso propanol كما هو موضح سابقاً، أضف إلى pellet TFA الموجود في الأنابيب M two مقدار M one من كاشف degra المكون من حمض الخليك، وحمض النيتريك، والماء، بنسبة حجم إلى حجم تتراوح من 8:1 إلى 2:1. أغلق الأنبوب بإحكام، ثم قم بالرج باستخدام vortex والتسخين على وحدة تسخين عند 100 °C لمدة 30 دقيقة. ونتيجة لهذه المعالجة، يتبقى السليلوز المتبلور فقط في الـ pellet.

يتم تميؤ جميع السكريات المتعددة الأخرى؛ بَرّد العينات الموجودة في الكتلة على الثلج حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة أو أقل. ثم قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 10,000 RPM لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي مع ضمان عدم تعكير الراسب وعدم إزالة أي مادة منه. ولهذا الغرض، اترك حوالي 150 microliters من السائل الطافي في الأنبوب، ثم اغسل الراسب عدة مرات بالماء.

بعد ذلك، قم بإجراء عملية تحلل مائي باستخدام حمض الكبريتيك المركز من أجل تحلل البلورات وكريات السليلوز بالكامل إلى جلوكوز. ابدأ بإضافة 175 µL من حمض الكبريتيك بتركيز 72% إلى أنبوب sarta واحضن العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد فترة الحضانة الأولية، قم برج العينة بجهاز vortex ثم حضنها لمدة 15 دقيقة أخرى.

ثم أضف 825 µL من الماء، وقم بعمل خلط دوامي (vortex) وطرد مركزي للعينات بسرعة 10,000 RPM لمدة خمس دقائق. قد تتبقى بعض المواد البنية والقابلة للذوبان، ومعظمها من اللجنين، في الأنبوب بينما يتواجد الجلوكوز في الطافي. يتم قياس محتوى الجلوكوز في الطافي باستخدام مقايسة الأنثرون اللونية (Colorimetric anthrone assay).

يتم إجراء هذا المقايسة في لوحة معايرة دقيقة من البوليسترين مكونة من 96 بئراً. قم بإعداد منحنى قياسي للجلوكوز في مكررات وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق. جهز العينات عن طريق دمج 10 µL من كل عينة (السائل الطافي) و90 µL من الماء في آبار منفصلة في نفس لوحة المعايرة الدقيقة المستخدمة للمعيار، ثم اختتم العملية بإضافة 200 µL من الكاشف المحضر حديثاً.

بعد ذلك، يتم تسخين الطبق لمدة 30 دقيقة عند 80 °C في فرن مزود بموزع حرارة من الألومنيوم. لاحظ تحول العينات التي تحتوي على الجلوكوز من اللون الأصفر إلى الأخضر المزرق عند اكتمال عملية التسخين. اترك الطبق ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة ثم رجه جيداً.

قم بقياس الامتصاص عند 625 نانومتر باستخدام قارئ أطباق المعايرة الدقيقة. يتم حساب محتوى الجلوكوز، وهو الوحدة البنائية للسليلوز، بناءً على الامتصاص مقارنةً بمنحنى القياس الذي تم إنشاؤه على نفس الطبق. فيما يلي بعض النتائج النموذجية لتحليل السكريات المتعددة لقطعة من خشب الحور.

يتم تحديد قمم الكروماتوجرام الغازي من خلال أنماط الكتلة و/أو أزمنة الاستبقاء للمواد القياسية. وتُقاس كمية السكريات الأحادية استناداً إلى منحنيات قياسية. ويظهر تحليل السكريات للسكريات المتعددة في المصفوفة وفرة عالية من الزيلوز مما يشير إلى وجود الهيميسليلوز، ولكن تتوفر سكريات أخرى أيضاً.

وفقاً للتحليل، فإن 40% من مادة الحور تتكون من الكريستال والسيليلوز. يرجى ملاحظة أن هذه المحتويات والتركيبات قد تختلف من نبات إلى آخر أو بين التشريحات النباتية المختلفة. لقد أوضحنا لكم كيفية تحديد محتوى متعدد السكاريد والتحليل التركيبي للكتلة الحيوية اللجنو-سيليلوزية لتحليل لجنين البوليفينول.

تابعوا الجزء الأول. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.