كريستوفر هيوز : حدث في نموذج المختبر لدراسة الأوعية الدموية (مقابلة)

مرحباً، اسمي الدكتور كريستوفر هيوز. أنا بروفيسور في جامعة كاليفورنيا إيرفاين، ويعمل مختبري على دراسة تكوّن الأوعية الدموية. ونحن مهتمون بشكل خاص بالجينات التي تنظم عملية تكوّن الأوعية الدموية.

لقد قمنا بتحسين اختبارات في المختبر بناءً على عمل Nelson وزميله، وفي هذا الاختبار يمكننا دراسة جميع العمليات المختلفة التي تحدث أثناء تكوين الأوعية الدموية، حيث نقوم بتغليف حبيبات tedex، وهي حبيبات صغيرة، بالخلايا البطانية. بعد ذلك، ندمج هذه الحبيبات في هلام الفبرين، ثم نوفر عوامل النمو.

وعلى مدار عدة أيام، تبرز الخلايا البطانية من الخرزات؛ حيث تهاجر، وتصطف، وتتكاثر، وتُشكل أنابيب، وتتفرع، ثم تُكوّن تشابكات وعائية. وبحلول اليوم العاشر تقريبًا، نحصل على شبكة كاملة تشبه الشعيرات الدموية في المزرعة.

حسنًا، تكمن بعض المشكلات في فحوصات تكوين الأوعية الدموية داخل الكائن الحي (in vivo)، على سبيل المثال تلك التي تُجرى على الفئران، في أن التحكم في النظام ليس سهلاً للغاية. فمن الصعب تصور ما يحدث عندما تتم هذه العملية داخل حيوان، إذ لا يمكنك رؤية تكوين الأوعية الدموية وهو يحدث بالفعل. أما إذا كنت ترغب في التحكم في النظام في المزارع المختبرية (in vitro)، فمن السهل جدًا إجراء تعديل وراثي للخلايا البطانية، وتفعيل الجينات أو إيقافها، ومن ثم مراقبة تأثيرات ذلك على تكوين الأوعية الدموية بالتبرعم.

ويعد القيام بذلك في الحيوان بالكامل أكثر صعوبة؛ إذ يتعين عليك إجراء تعطيل جيني (knockouts) أو إدراج جيني (knockins). لذا، فهاتان هما الميزتان الرئيسيتان.

إنها سهلة التداول ومن السهل تصورها. لذا، على مر السنين، تم تطوير عدد من مقاييس تكوين الأوعية الدموية المختلفة في المختبر (in vitro)، ولكل منها مزاياها وعيوبها. ومن المقاييس المعروفة على وجه التحديد مقياس هلام المصفوفة (matrix gel assay)، حيث توضع الخلايا البطانية فوق هذه المصفوفة خارج الخلوية التي تسمى matrigel.

والمشكلة هناك تكمن في أن الخلايا البطانية تشكل تراكيب تشبه الحبال، لكنها لا تشكل أبداً أوعية دموية ذات تجويف سليم. فلا نلاحظ وجود تبرعم أو تشكل وصلات وعائية. وهناك نماذج هلام الكولاجين، والتي يمكن أن تكون فعالة.

هناك العديد منها، حيث لا يظهر تكاثر للخلايا البطانية. ولا يميل ظهور التفاغم. يعتمد مقايسة هلام الفيبرين التي طورناها على نموذج وضعه نيلسون كار ونُشر في منتصف التسعينيات.

وقد قمنا الآن بتحسين ذلك بشكل كبير بحيث يمكننا رؤية جميع مراحل تكوين الأوعية الدموية. إذ يمكننا مراقبة التبرعم الأولي، والهجرة. ونرى تكاثر الخلايا، وتشكّل اللمعة، ثم يحدث التفرع، وفي النهاية نحصل على التفاغم لتشكيل شبكة وعائية كاملة في المختبر.

لذا، فإننا نؤمن بأن هذا المقايسة هي حقاً أفضل نظام في المختبر متاح إذا كنت ترغب في دراسة جميع تلك المراحل المختلفة من تكوين الأوعية الدموية. وميزة أخرى نوفرها من خلال هذه المقايسة المختبرية هي قدرتنا على إجراء التشريح الدقيق بالتقاط الليزر، حيث يمكننا تدوير المزرعة حتى تصبح مسطحة للغاية، ثم استخدام مجهر التشريح الدقيق بالتقاط الليزر. وبإمكاننا فعلياً استخراج خلايا فردية، ونحن مهتمون بشكل خاص بالخلايا الطرفية.

وبذلك نقوم بقص هذه الأجزاء، وبإمكاننا فحص التعبير الجيني، لا سيما في خلايا الطرف مقابل خلايا الجذع، وهي الخلايا التي تشكل التجويف فعلياً. وفرضيتنا هي أنه سيكون هناك تعبير جيني متباين بين هاتين المجموعتين من الخلايا. يمكننا دراسة ذلك، بينما سيكون من المستحيل تقريباً القيام بذلك في نظام حي.

لذا نعتقد أن هذه ميزة رئيسية أخرى لاستخدام هذا المقايسة المختبرية (in vitro Assay). في الأعمال المبكرة التي أجريت في هذا المجال، كما ذكرتُ عن نيلسون ريكون، استخدموا خلايا بطانية وعائية دقيقة. وهناك اعتقاد سائد بأن الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة هي الخلايا التي يفضل استخدامها في مقايسة كهذه، لأنه في الجسم الحي (in vivo)، تكون الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة هي التي تقوم فعلياً بتكوين أوعية جديدة.

لقد قررنا تجربة ذلك باستخدام خلايا HUVEC. وهذه عبارة عن خلايا بطانية من الوريد السري البشري وذلك لعدة أسباب، أحدها هو أن هذه الخلايا سهلة الحصول عليها للغاية.

يمكنك الذهاب إلى المستشفى والحصول على الحبال السرة من أجنحة الولادة، ويمكنك عزل الخلايا بسهولة تامة. كما أن هذه الخلايا قد استُخدمت في المزارع الخلوية لسنوات عديدة، وهي موصفة بدقة عالية.

وبناءً على ذلك، قمنا بإعداد هذا المقايسة وتحسينها حتى نتمكن من استخدام هذه الخلايا لتلك الأسباب. ومن المثير للاهتمام أنه تبين أن خلايا البطانة الوعائية للأوعية الكبيرة، هذه الخلايا، تبدو وكأنها تتخذ شكل خلايا البطانة الوعائية الدقيقة عند استزراعها؛ إذ تفقد الكثير من الجينات التي يتم التعبير عنها عادةً بواسطة خلايا البطانة الوعائية للأوعية الكبيرة، وتبدأ في التعبير عن جينات ترتبط عادةً بخلايا البطانة الوعائية الدقيقة.

وهي قادرة تماماً على تكوين براعم شبيهة بالشعيرات الدموية وتكوين تجاويف، مما يجعلها تبدو في المزرعة وكأنها شعيرات دموية حقيقية. لذا فهي سهلة الاستخدام، وهي تفعل ما نريده منها؛ إذ تنمو براعمها وتكون أوعية ذات تجاويف سليمة.

عندما نرغب في تقدير هذا المقايسة كمياً، هناك في الواقع عدة طرق يمكننا اتباعها. يمكننا النظر في معايير كمية دقيقة مثل عدد البراعم، وطول البراعم، وقطر البراعم، وعدد نقاط التفرع، وعدد التفاغرات، ولكننا ننظر أيضاً في معايير نوعية. وبذلك، يمكننا التحقق مما إذا كانت هذه البراعم تشكل تجاويف.

وهذا على الأرجح هو الأمر الذي يهمنا أكثر من غيره؛ ففي الكثير من المقاييس التي نجريها، نهتم بتكوين اللمعة بشكل سليم. ويعد ذلك تقييماً نوعياً في المقام الأول، على الرغم من أنه مع زيادة حجم الأوعية، يمكن قياس قطر تلك اللمعات أيضاً.

لذا، نستخدم الخلايا الليفية في هذه المزارع. نقوم بتضمين الحبيبات داخل هلام الفبرين، ثم نضع الخلايا الليفية فوق الهلام. تُعد الخلايا الليفية ضرورية للغاية لعملية التبرعم وتكوين التجويف بشكل صحيح.

في غياب الخلايا الليفية، يحدث بعض التبرعم. ومع ذلك، تميل الخلايا البطانية إلى عدم البقاء متصلة ببعضها البعض، وما يحدث هو أنها تهاجر مبتعدة عن بعضها البعض.

وبالتالي، فإن أي بنية تقوم بتطويرها على هذا البرعم تميل إلى التفكك. وبعد بضعة أيام، تخضع الخلايا البطانية لموت خلوي مبرمج (apoptosis). لذا يبدو أن الخلايا الليفية تنتج عوامل أساسية لتكون الأوعية الدموية، على الأقل في هذا النظام المختبري (in vitro).

وقد كنا مهتمين للغاية بمعرفة ماهية هذه العوامل. وما وجدناه هو أن الخلايا الليفية تفرز مادة ما في الوسط، لذا يمكننا أخذ وسط مُكيّف من الخلايا الليفية وسيعمل ذلك على دعم التبرعم وتكوين التجويف بشكل سليم. لذا، نحن نتعامل بالتأكيد مع عامل ذائب.

من الواضح أننا مهتمون جداً بمعرفة المادة التي تنتجها الخلايا الليفية وتكون بهذه الأهمية لعملية تكوّن الأوعية الدموية في هذا النظام. لقد جربنا جميع العوامل المشتبه بها عادةً، مثل VEGF وbasic FGF، وهي موجودة بالفعل في المزرعة، ولكن إضافة المزيد منها لا يغني عن وجود الخلايا الليفية. كما جربنا أيضاً angiopoietin one وTGF beta وHGF وغيرها من العوامل.

حتى الآن لم نجد العامل الحيوي. لذا، نقوم حالياً بتنقية العوامل من الوسط المكيف من الخلايا الليفية. حيث نقوم بتمرير الوسط المكيف عبر أعمدة مختلفة، مثل أعمدة التبادل الكاتيوني والاستبعاد الحجمي، ونحصل على أجزاء من ذلك الوسط تظهر نشاطاً.

ونحن نقوم الآن بتتبع ذلك النشاط، حيث نأخذ تلك الأجزاء ونحدد أيها نشط، ومن ثم يمكننا تشغيلها على هلامات الفصل الكهربائي (gels)، للتأكد من وجود عدد قليل نسبياً من النطاقات على الهلام، وبعد ذلك يمكننا قصها وإجراء التسلسل لها بواسطة مطياف الكتلة (mass spec). وقد منحنا ذلك الكثير من البيانات المثيرة للاهتمام؛ حيث لدينا الآن عدد كبير من الجينات المرشحة التي نختبرها بشكل فردي لمعرفة ما إذا كانت هي بالفعل العامل الذي نبحث عنه.

لقد اختبرنا العديد من عوامل تكوين الأوعية الدموية المعروفة، ونعلم أن veg GF و basic FGF ضروريان في الواقع من أجل التبرعم السليم في هذا المقايسة. ولكنها ليست القصة كاملة؛ فهناك عوامل مشتقة مهمة كما ذكرت، وأحد الطرق التي بحثنا من خلالها هذا الأمر هو أخذ خلايا ورمية، والتي تكون ذات قدرة عالية على تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي، حيث تسبب أوراماً كبيرة في الفئران وتكون ذات تروية وعائية عالية.

وقد فحصنا هذه الخلايا الورمية ووجدنا أنها تعبر عن مستويات عالية جداً من vegf، وقمنا بإضافتها إلى مزارعنا. لذا فقد استبدلنا الخلايا الليفية بهذه الخلايا الورمية، وتبين أنها لا تدعم عملية تكوين أوعية دموية قوية في هذا المقايسة. وهذا أمر مثير للاهتمام للغاية.

ما يشير إليه ذلك، وهو ما اقترحه آخرون أيضاً، هو وجود تواصل تبادلي بين الورم والسدى (stroma)، والتي تتكون من الخلايا الليفية والخلايا الداعمة الأخرى في النسيج، وبين الخلايا البطانية. وقد يكون من المحتمل أن الخلايا الورمية تنتج بعض العوامل التي تعمل مباشرة على الخلايا البطانية، ولكنها تنتج أيضاً عوامل أخرى تحفز الخلايا الليفية والخلايا السدوية الأخرى على إنتاج عوامل تدعم بدورها عملية تكوين أوعية دموية قوية.