الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

نصف في هذا المقال بروتوكولاً لنمو وتوسيع الخلايا الظهارية القصبية البشرية من قطع قصبية بشرية معزولة حديثاً. يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام: الترميز والخدش، وأطباق الزرع بقطر مائة مليمتر، وترميم الأنسجة القصبية، وزراعة الأنسجة القصبية المستأصلة، وتمرير الخلايا الظهارية القصبية البشرية النامية ذات الأهداب، والخلايا الظهارية القصبية البشرية على مرشحات Transwells. قبل البدء، يرجى ملاحظة أن جميع الخطوات يتم تنفيذها داخل كابينة السلامة البيولوجية.

ما لم ينص على خلاف ذلك، يرجى قراءة قسم المواد والكواشف والتحضير والتأكد من جاهزيتكم الأساسية. يجب تنفيذ عمليات الترميز التالية، ومزرعة المحلول المخزون، والوسط، ومحاليل التفكيك، والطلاء والخدش في أطباق زرع بقطر مئة مليمتر وفقاً لأفضل الممارسات.

حافظ على تعقيم كل شيء. ضع أطباق زراعة معقمة بحجم مائة مليمتر ومحلول الطلاء. باستخدام ماصة BST، ضع 2 مل من محلول الطلاء في طبق بحجم مائة مليمتر، ثم قم بتحريكه بشكل دائري لتغطية قاعدة الطبق.

تأكد من أن محلول الطلاء يغطي قاعدة الطبق بشكل متساوٍ. اسحب المحلول المتبقي بواسطة الماصة واستخدمه لطلاء طبق ثانٍ بمقاس مائة مليمتر. كرر العملية لعدد الأطباق المطلوبة.

يختلف عدد الأطباق المطلوبة باختلاف عدد المستأصلات النسيجية. تأكد من أن محلول الطلاء يغطي قاعدة الأطباق بالتساوي، كما هو موضح.

قم بتغطية الأطباق بأغطيتها. اترك الأطباق لتجف في الحاضنة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين، ثم قم بشفط المحلول الزائد قبل الاستخدام لزراعة أنسجة الشعب الهوائية. يمكن وضع أطباق الزرع المطلية غير المستخدمة في كيس معقم وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C لاستخدامها لاحقاً.

استخدم مقصات صغيرة وحادة، ومشرطاً، وملاقط معقمة بواسطة 70%ethanol، ثم انقل الأطباق المطلية إلى كابينة السلامة البيولوجية (BSC) وقم بإحداث خدوش فيها عن طريق الضغط بقوة باستخدام المشرط لتشكيل علامات XS صغيرة وعميقة، بمعدل أربعة على الأقل لكل طبق. إذا لم يكن الخدش عميقاً بما يكفي، فلن تستقر قطع الأنسجة في المحاقن وستطفو خارجها. ضع الأنسجة في طبق P three داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC). اشطف أنسجة القصبات البشرية المعزولة جيداً باستخدام Bss out.

افتح القطع القصبية. انقل الأنسجة إلى محلول BS ثم انقلها إلى طبق زراعة أنسجة معقم بحجم 100 مليمتر يحتوي على DM EM ham F 12 مبرد مضاف إليه 1% antibiotic anti mycotic. استخدم مقصاً صغيراً وحاداً لتقطيع الأنسجة إلى قطع مكعبة يتراوح حجمها بين 2 إلى 3 مليمتر.

ضع قطعة واحدة من النسيج المقطوع في مركز كل X باستخدام الملقط واضغط عليها. اترك قطع النسيج أو مستنبتات X تلتصق بالطبق برفق لبضع ثوانٍ. ثم أضف برفق 10 mL من الوسط الغذائي الكامل. إذا طفا النسيج بعد إضافة الوسط الغذائي، استخدم الملقط لدفع النسيج داخل حواف X أو قم بعمل X جديدة. قد يكون من الضروري عمل Xs جديدة إذا لم تكن الحواف عميقة بما يكفي.

ضع الأطباق في الحاضنة وقم بتغيير الوسط الغذائي كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصبح الأنسجة جاهزة للزراعة. عندما تنمو خلايا ظهارية كافية حول الأنسجة لتغطية مساحات تتراوح بين 1 إلى 2 cm، وهو ما يستغرق أربعة أسابيع تقريبًا. استخدم أطباقًا مطلية ومخدوشة بقياس 100 mm.

بما أن بعض عمليات استزراع الأنسجة قد لا تنجح، فإن عدد الأطباق يعتمد على عدد قطع الأنسجة التي سيتم نقلها. في حال استخدام أطباق تم طلاؤها مسبقاً وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C، يجب تركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. باستخدام الملقط، ارفع الأنسجة بعناية من الطبق الأصلي وضعها في مركز المحور في الطبق الجديد مع الضغط برفق. يجب التخلص من الأنسجة التي لا تظهر نمواً خارجياً.

اترك الأنسجة تلتصق بالطبق. أضف الوسط الغذائي بعد بضع ثوانٍ ثم قم بالتحضين. أضف ما تم وصفه سابقًا لشرح X.

لذا، يتم استخدام 2 mL من المحلول المخزون من trypsin وEDTA لكل طبق زراعة أنسجة بحجم 100 mm. يُخفف المحلول المخزون بإضافة 6 mL من PBS عقم بتركيز 0.01 M، حيث تضاف 2 mL من المحلول المخزون إلى 6 mL من PBS للوصول إلى تركيز نهائي من trypsin يبلغ 250 µg/mL ومن EDTA يبلغ 100 µg/mL. بعد نقل المستأصلات إلى طبق جديد، يتم سحب الوسط من الأطباق التي تحتوي على حلقات خلوية يتراوح قطرها بين 1 إلى 2 cm.

أضف ثمانية مليلتر من قطرات مخففة دافئة ومحلول edt إلى كل طبق سعة 100 مليمتر. ثم ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 3 إلى 15 دقيقة. تحقق من النتائج بشكل متكرر.

سيؤدي ترك التربسين لفترة طويلة جداً إلى إتلاف الخلايا. افحص الأطباق تحت المجهر للتأكد من رفع معظم الخلايا؛ حيث ستصبح الخلايا مستديرة وتنفصل كما هو موضح عند ثمانية ميكرونات من الدفء. أضف 10% FBS في الوسط لكل طبق لإبطال مفعول محلول EDTA.

اجمع أحجام السوائل من جميع الأطباق في أنبوب واحد أو في أنابيب منفصلة حسب الأنسجة المختلفة. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس هيمسيتوميتر (Hema Cytometer)، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي عند 100 ×g لمدة خمس دقائق. ستتكون كرة خلوية (cell pellet) في قاعدة الأنبوب؛ أعد تعليق الكرة الخلوية في وسط غذائي كامل للوصول إلى تركيز الخلايا المطلوب.

ضع من مليوني إلى 3 ملايين خلية في كل قارورة T 75 وأضف الوسط الغذائي الكامل حسب الحاجة. يتم التحضين وتغيير الوسط الغذائي. وتنمو الخلايا لتصل إلى مرحلة ما قبل الاندماج (sub confluence) في قارورات D 75 كل ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

خلال أربعة أسابيع تقريباً، يجب رفع الخلايا وتوسيعها أو استخدامها قبل وصولها إلى مرحلة التلاقي الكامل لمنع الشيخوخة الخلوية. ابدأ بتجهيز الأغشية النفاذة للمجاري العابرة (transwells). استخدم الإدراجات بحجم 6.5 مليمتر التي تتناسب مع أطباق متعددة الآبار تحتوي على 24 بئراً.

أضف الوسط الغذائي إلى كلا جانبي الغشاء. 0.6 مليلتر في الأسفل و 0.1 مليلتر في الأعلى. احضن العينة لمدة ساعة واحدة في حاضنة زراعة الخلايا.

قم بإزالة الوسط بدقة من كلا جانبي الغشاء. ابدأ بالحجم القاعدي أولاً بحذر، حيث يمكن أن يتضرر الغشاء بسهولة. لذا، قم بسحب الوسط بواسطة الماصة على جانب قطعة الغرس الزرعي، واستخدم الحجم الموصى به.

سيؤدي عدم القيام بذلك إلى تسرب الوسط إلى الآبار الأخرى المخصصة لاستزراع الخلايا. بعد التحضين المسبق للدعامة النفاذة، انقل بعناية معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى الجانب القمي للغشاء، بمعدل 0.1 ml من معلق الخلايا إلى الجانب القمي للغشاء في الآبار التي يبلغ قطرها 6.5 millimeter. ثم أضف 0.6 ml من الوسط إلى الجانب القاعدي للغشاء باستخدام الماصة.

قم بتغذية الخلايا من الجانبين القمي والقاعدي لمدة 10 أيام. ولإنشاء مزرعة متميزة جيداً، يتم استبدال الوسط مرتين في الأسبوع. وباستخدام الطريقة الموضحة، قم بإزالة الحجم القاعدي.

أولاً، لاستبدال الحجم العلوي، أضف 0.6 mils من الوسط إلى الجانب القاعدي للغشاء. تعزز هذه الطريقة التصاق الخلايا بالغشاء وتمنع تعرض الخلايا للهواء لفترات زمنية طويلة. استبدل الأوساط بسرعة وأعدها إلى الحاضنة.

قم بإنشاء واجهة الهواء والسائل في اليوم العاشر عن طريق إزالة وسط AAL واستبدال 0.6 mil من الوسط على الجانب القاعدي للغشاء. حافظ على الخلايا في واجهة الهواء والسائل لمدة ستة أسابيع مع تغيير الأوساط مرتين في الأسبوع. ستبدأ الخلايا المهدبة في الظهور بعد أربعة أسابيع من إنشاء الواجهة.

الواجهة السائلة. ستتحقق الخلايا من تمايز منتظم إلى خلايا مهدبة. ستة أسابيع بعد إنشاء الواجهة السائلة للأذن.

قطاعات شعبية بشرية تحتوي على خلايا ظهارية سليمة من عينات الاستئصال والزراعة. في دراستنا، تمت زراعة أنسجة شعبية بنجاح من عينات الاستئصال في ثماني من أصل تسع أنسجة. وبما أن إحدى المزارع المستأصلة قد أصيبت بالعدوى، فقد وصلت حلقات الخلايا الظهارية إلى نصف قطر يتراوح بين 1 إلى 2 cm في غضون ثلاث إلى أربع أسابيع.

تم استزراع نماذج X التفسيرية الناجحة مجدداً بما يصل إلى ست مرات. وتظهر جميع المزارع الناجحة دليلاً على هجرة الخلايا خلال 48 ساعة من بدء عمليات الزرع، أو تظهر نماذج X التفسيرية كما هو موضح في الخلايا B مظهراً يشبه رصف الحجارة، وهو مظهر مميز لهذه الخلايا الظهارية كما هو موضح في B. وفي الأشكال اللاحقة، كشف التلوين المناعي لتحضيرات السيتوزين للخلايا من النموذج التفسيري والخلايا المزروعة على شرائح غطاء أن جميع الخلايا كانت إيجابية للسيتوكيراتين النوعي للظهارة، وتظهر هنا الخلايا الشعبية البشرية المستزرعة فرعياً حتى الوصول إلى مرحلة ما قبل الالتحام في دوارق T 75. لاحظ المظهر الذي يشبه رصف الحجارة.

أظهرت الخلايا الشعبية البشرية المستزرعة صبغة مناعية إيجابية منتظمة لبروتين kerin و E.Can، بينما لم تظهر الصبغة المناعية باستخدام أجسام مضادة محددة لأنواع الخلايا الأخرى أي مؤشر على تلوث المزارع بالخلايا الليفية، أو الخلايا الميزنشيمية، أو الخلايا البطانية. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى الشكل 5 والشرح المرفق به في النص. تتمايز الخلايا المستزرعة على أغشية البوليستر permeable membranes أو transwells مع وجود واجهة سائلة إلى ظهارة مهدبة كما هو موضح هنا؛ ويجب التخلص من الخلايا وزراعاتها إذا بدأت في الظهور خلايا ذات شكل مورفولوجي مختلف عما هو موضح هنا. قدمنا في هذا البروتوكول طرقاً مفصلة لاستزراع وتوسيع الخلايا الظهارية الشعبية البشرية الأولية.

هناك حاجة إلى دراسات قائمة على الخلايا البشرية لتحديد المسارات الهامة لآليات أمراض الرئة البشرية ولإجراء الفحص السمومي والدوائي للأدوية الجديدة. ونأمل أن تشجعكم الطرق الموصوفة هنا على استزراع الخلايا الظهارية القصبية البشرية من المستأصلات واستخدام هذه الخلايا في أنظمة دراساتكم. شكراً لكم وتمنياتنا لكم بالتوفيق.