تحديد الوظيفة الهدبية وعدم نفاذية الغشاء في ظهارة مجرى الهواء الرئوي الكاذب

يهدف بحثنا إلى قياس خاصيتين فيزيائيتين حيويتين حاسمتين لظهارة مجرى الهواء الكاذب ، والتي يمكن الحصول عليها عن طريق التفريق بين الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعية في واجهة سائل الهواء. حددنا سمات مختلفة لفيروسات الجهاز التنفسي المختلفة باستخدام ظهارة مجرى الهواء الكاذبة. على سبيل المثال ، التهاب الهيكل الخلوي الذي يحركه الفيروس المخلوي التنفسي ، وهو آلية غير قانونية لالتهاب القصيبات.

حددنا أيضا أن تضخم خلايا الكأس يزيد من تكاثر SARS-CoV-2 في ظهارة مجرى الهواء المزمن الانسداد الرئوي. ركزنا على توضيح آلية التعديل الذي يحركه الفيروس المخلوي التنفسي لإشارات الهيكل الخلوي لتحديد الأهداف العلاجية الجديدة لمكافحة عدوى الفيروس المخلوي التنفسي والتهاب القصيبات الناجم عن الفيروس. للبدء ، خذ تعليق الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعي ، أو NHBE.

باستخدام ماصة P200، أضف 50,000 خلية معلقة في 200 ميكرولتر من الخلية الظهارية الكاملة لمجرى الهواء، أو AEC، المتوسطة إلى الجانب القمي من الملحق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 85٪ إلى 95٪. بمجرد أن تتلاقى الخلايا ، انقل الإدخالات إلى بئر فارغ باستخدام ملقط معقم.

باستخدام ماصة P1000، قم بشفط كل وسط AEC الأساسي. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسط تمايز ALI الكامل الطازج المكمل ب 2٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ أمفوتريسين ب إلى البئر القاعدية. باستخدام ملقط معقم ، انقل الإدخالات إلى البئر القاعدي باستخدام وسط ALI الكامل المضاف.

باستخدام ماصة P200، قم بشفط وسط AEC القمي برفق من البئر واحتضانه. بعد 48 ساعة ، انقل الإدخالات إلى بئر فارغ باستخدام ملقط معقم. باستخدام ماصة P1000، قم بشفط الوسط القديم وأضف 500 ميكرولتر من وسط ALI الطازج الكامل.

ضع الحشوات مرة أخرى في البئر بوسط جديد باستخدام ملقط معقم. في اليوم 26، باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من DPBS إلى الجانب القمي من الإدخالات. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بشفط DPBS باستخدام ماصة P200. للبدء ، قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر المرفق وغرفة البيئة. افتح باب الغرفة وضع اللوحة التي تحتوي على الإدخالات مع خلايا NBHE على مرحلة المجهر.

بمجرد أن تصبح اللوحة على المسرح ، أغلق الغرفة. بعد ذلك ، استخدم مقبض تشغيل مرحلة المجهر لتحريك اللوحة وإبراز الإدخالات. على شاشة الكمبيوتر ، انقر فوق أيقونة نظام SAVA لفتح برنامج SAVA.

على واجهة البرنامج، انقر فوق تكوين التجربة. في علامة التبويب التالية ، انقر فوق إنشاء تجربة. بعد ذلك، في علامة التبويب الجديدة، أدخل الدليل حيث سيتم تخزين البيانات في حقل إدخال اسم دليل التجربة وقدم التفاصيل في حقل إدخال وصف التجربة، ثم انقر على موافق. الآن ، انقر فوق التجربة التي تم إنشاؤها وتظهر في الدليل ضمن قسم التجارب.

بعد ذلك ، انقر فوق تعديل وقدم تفاصيل عينة في حقل وصف العينة. انقر على إضافة، ثم انقر على خروج لمغادرة علامة التبويب. على واجهة البرنامج الرئيسية، حدد التجربة التي تم إنشاؤها من القائمة المنسدلة في فتحة التجربة.

ثم انقر فوق تسجيل الفيديو لمراقبة تردد النبض الهدبي على شاشة الكمبيوتر. ستعرض الشاشة حركة هدبية مركزة. لكل إدراج ، سجل ستة حقول عشوائية مختلفة لمدة 2.1 ثانية بمعدل 120 إطارا في الثانية.

انقر فوق حفظ الفيديو لمراقبة بيانات تردد النبض الهدبي. لتحليل البيانات ، انقر فوق تحليل الفيديو على واجهة البرنامج. وفي علامة التبويب التالية ، انقر فوق موافق. ثم انتقل إلى علامة التبويب التالية وانقر على تحليل الكل.

قم بتنزيل جدول البيانات الذي تم إنشاؤه لكل تجربة في مجلد الحصول على بيانات SAVA على الكمبيوتر. خذ متوسط التردد الغوسي لعرض البيانات. وصل تردد النبض الهدبي إلى ثلاثة هرتز على الأقل لكل من ظهارة مجرى الهواء للبالغين الأصحاء والمصابين بمرض الانسداد الرئوي المزمن ، مما يدل على وظيفة هدبية مماثلة.

للبدء ، قم بتشغيل مقياس الأومتر EVOM2 فولت باستخدام مفتاح الطاقة. قم بتوصيل مقاوم الاختبار ب EVOM2 في فتحة الإدخال. راقب القراءة على شاشة EVOM2.

إذا كانت القراءة أعلى أو أقل من 1,000، فقم بتشغيل مفتاح ADJ على EVOM2 باستخدام الملقط حتى تظهر قراءة موحدة 1,000 لمعايرة الجهاز. الآن ، خذ إدخالا فارغا لقراءة التحكم التجريبي. باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من DPBS إلى الجانب القمي من الملحق الفارغ.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS إلى الجانب القاعدي باستخدام ماصة P1000. بعد ذلك ، افصل مقاوم الاختبار وقم بتوصيل قطب STX2 بفتحة الإدخال في EVOM2. بعد ذلك ، قم بتنظيف قطب STX2 برفق باستخدام 70٪ من الإيثانول.

أدخل قطب STX2 في الملحق الفارغ باستخدام DPBS ، مع الحفاظ على ساق القطب الأقصر على الجزء القمي وساق القطب الأطول في الجزء القاعدي. الآن ، سجل القراءة المستقرة على شاشة EVOM2. بعد ذلك ، باستخدام ماصة P200 ، أضف 100 ميكرولتر من DPBS إلى الجانب القمي من الملحق.

أدخل قطب STX2 في الملحق باستخدام ظهارة مجرى الهواء المتمايزة لمدة 26 يوما ، كما هو موضح سابقا. ثم سجل القراءة المستقرة على شاشة EVOM2. زادت قيم المقاومة الكهربائية عبر الظهارة لدى البالغين المصابين بمرض الانسداد الرئوي المزمن ، مما يشير إلى تعزيز نفاذية الغشاء في مرض الانسداد الرئوي المزمن.