تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في الحصول على أجنة نامية مشتقة من مواقع Oocytes التي تم التلاعب بها في المزرعة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل مواقع oo المانحة من أنثى واحدة ومعالجتها حسب الرغبة في المزرعة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحفيز هذه cytes على النضج باستخدام البروجسترون، وحقن الإناث المضيفة المحتملة بـ gonadotropin لتحفيز وضع البيض.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في صبغ الخلايا المانحة بالصبغات الحيوية وتجهيز أنثى لتعمل كمضيف. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي نقل الخلايا المانحة جراحياً إلى التجويف الجسمي للمضيف، وبعد عدة ساعات يتم استعادة البويضات المنقولة وتخصيبها. وفي النهاية، يتم الحصول على أجنة تنقسم بشكل طبيعي مشتقة من المانح الذي خضع للتلاعب التجريبي.

يمكن الحصول على الخلايا وتحليلها تماماً مثل الأجنة الطبيعية. مرحباً، أنا دوغ هيوستن من جامعة أيوا. نحن اليوم في دورة Cold Spring Harbor Xap لنوضح لكم كيفية إجراء عملية نقل المضيف.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أدوار نواتج الجينات الأموية وتحديد أدوارها في التطور المبكر لـ zap. لذا، فلنبدأ. قبل البدء في الجراحة، تأكد من تعقيم منطقة الجراحة ومن جاهزية الأوساط الغذائية الطازجة والأدوات المعقمة.

أمسك إبرة الخياطة في حامل الإبر بالاتجاه المطلوب. ضع ضفدعاً أنثى مخدراً على ظهره فوق مسحة جراحية مبللة. وباستخدام مقص قزحية صغير، اصنع شقاً بطول واحد سنتيمتر في الجلد في الجزء السفلي من البطن، جانبياً بالنسبة للخط الناصِف.

تجنب القطع في العضلة البطنية. استخدم الملقط لرفع طبقة العضلات واللفافة المحيطة ذات اللون الأبيض. استخدم مقص القزحية لإجراء قطع سريع واحد ومباشر عبر العضلة.

قم بتوسيع الشق بمقدار سنتيمتر واحد للكشف عن المبيض. استخدم الملقط للإمساك بالمبيض وسحب أحد الفصوص. استخدم المقص لقص الفص عند مستوى جدار الجسم.

ضع النسيج في طبق قطر 90 مليمتر يحتوي على وسط استزراع البويضات أو OCM، ثم قم بتقييم جودة المبيض فوراً تحت مجهر تشريحي. يمكن إزالة بعض البويضات باستخدام الملقط. إذا كانت البويضات متماسكة ومتجانسة في الحجم واللون، قم بإزالة الكمية المطلوبة من نسيج المبيض من الضفدع وضعها في طبق بيتري قطر 90 مليمتر يحتوي على OCM.

أغلق الشق الجراحي. أدخل الإبرة على بعد بضعة مليمترات جانبيًا من الشق، مع التأكد من مرورها عبر كل من العضلة واللفافة. استخدم الملقط للتحكم في الإبرة، مع الحرص على عدم سحب طرف خيط الخياطة بالكامل.

أغلق الجرح باستخدام نمط غرز متقطعة بسيطة وعقد جراحية مربعة. تم وصف التقنية بالتفصيل في النص المرفق. كرر عملية الخياطة مع طبقة الجلد.

اشطفي الأنثى بالماء منزوع الأيونات وضعيها في دلو استشفاء مملوء بالماء البارد. فور الانتهاء من الجراحة، استخدمي مقصاً لتقسيم المبيض. قومي بفتح الفصوص الفردية، وبسطها، وتقطيعها إلى قطع مربعة بحجم سنتيمترين.

اشطف باستخدام وسط نظيف، واستخدم الملاقط لنقل خمس إلى ست قطع إلى طبق جديد بقطر 90 مليمتر يحتوي على OCM لعزل الخلايا الفردية. ابدأ بنقل إحدى القطع إلى طبق صغير يحتوي على الوسط وضعه تحت مجهر التشريح.

استخدم ملقط الساعات لنقل من 3 إلى 500 بويضة يدويًا. أمسك بطبقة النسيج الضام المحيطة ببويضة مكتملة النمو في المرحلة السادسة بالقرب من المخزون باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط. أمسك بالمبيض المجاور للبويضة باستخدام الزوج الأول من الملاقط.

اسحب برفق عبر البويضة لتمزيق طبقة الجريب. استخرج البويضة من النسيج بعناية وبنجاح. لا تحتوي البويضات التي أُزيلت جريبها على أوعية دم مرئية وتكون أكثر ليونة من البويضات ذات الجريبات السليمة.

استخدم ماصة مصقولة بالنار ومسدودة بقطنة لنقل مجموعات تتكون من 100 إلى 150 خلية بيضية إلى أطباق زراعة بقطر 60 مليمتر تحتوي على ثمانية مليلترات من OCM. تُحفظ الخلايا البيضية في أطباقها عند درجة حرارة 18 degrees Celsius. يمكن الآن إجراء الحقن المجهري للخلايا البيضية حسب الرغبة باستخدام oligonucleotides مضادة للمعنى أو mRNAs وفقاً لأي عدد من البروتوكولات، ثم تُزرع في OCM داخل حاضنة عند درجة حرارة 18 degrees Celsius.

استخدم البويضات للنقل خلال 96 ساعة من العزل في المساء السابق لإجراء عملية النقل. قم بتحضين الخلايا المطلوبة مع البروجسترون لإنضاجها بإضافة 16 µL من البروجسترون بتركيز 1 mM إلى الوسط الذي يحتوي على الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 µM. قم بالتحضين لمدة تتراوح من 10 إلى 12 ساعة عند 18 °C في المساء نفسه، ثم احقن ثلاث إلى خمس إناث بـ 1000 وحدة من هرمون موجّه الغدد التناسلية المشيمية البشري لكل ضفدع لتحفيز وضع البيض.

اترك الإناث في درجة حرارة الغرفة أو عند 18 درجة مئوية طوال الليل في صباح يوم النقل. افحص العينات تحت مجهر التشريح للتأكد من نضج الخلايا المستزرعة. أضف الأصباغ الحيوية ثم قم بالطرد المركزي بسرعة تزيد عن 10,000 Gs لمدة خمس دقائق.

لتقليل الخلفية الناتجة عن الحطام، أضف 80 µL من الصبغة الحيوية المناسبة إلى كل مجموعة تجريبية من البويضات. قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على هزاز (rocker). انقل البويضات المصبوغة إلى طبق قطر 90 mm يحتوي على o cm طازج وقم بتدويره لفترة وجيزة لغسلها.

قم بتصنيع ماصة لاستخدامها في نقل الخلايا. استخدم قلم ألماس لخدش الماصة الباستور على بعد حوالي سنتيمترين أسفل الجزء المستدق ثم اكسرها بدقة. سيؤدي ذلك إلى تكوين ماصة بفتحة قطرها 1.5 مليمتر، وهي مساحة كافية تماماً لاستيعاب بويضة واحدة.

قم بصقل الطرف حتى تصبح الحواف ملساء دون إغلاق الطرف. زراعة البويضات. يجب إجراء الجراحة بأسرع ما يمكن.

قم بإجراء شق كما سبق في أنثى مخدرة تضع بيضاً عالي الجودة. يجب أن يكون طول هذا الشق هو الحد الأدنى المطلوب ليتناسب تماماً مع قطر أداة النقل. اسحب كمية أقل من سنتيمتر واحد بواسطة الماصة.

قم بتحريك طبق البويضات التجريبية بشكل دائري لتجميعها في مركز الطبق. استخدم ماصة باستور المعدة لسحب أكبر عدد ممكن منها. اترك البويضات تستقر في نهاية الماصة لتقليل كمية السائل التي سيتم نقلها إلى الضفدع.

استخدم الملقط للإمساك بواحدة من سدائل العضلات واللفافة ورفعها. أدخل طرف الماصة في الشق واسمح للبويضات بالتدفق ببطء إلى تجويف الجسم. كرر العملية حتى يتم نقل جميع البويضات.

لا تترك طبقة العضلات تتحرر لمنع تسرب البويضات من الشق. استخدم الملاقط للإمساك بكلا جانبي الشق وتقريبهما من بعضهما البعض، مما يسمح للخلايا بالاستقرار في تجويف الجسم. ابدأ بخياطة طبقة العضلات واللفافة كما سبق، مع الحرص على الحفاظ على شد للأعلى حتى يتم ربط العقدة الأولى.

خِط skin الجلد. اشطف الضفدعة بالماء منزوع الأيونات واتركها لتتعافى كما سبق. يجب أن تبدأ الضفدعة في وضع البيض بشكل طبيعي بعد العملية، وذلك بدءاً من ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد الجراحة.

يتم استعادة البيوض عن طريق العصر المعتاد كل نصف ساعة حتى تتوقف الأنثى عن وضع البيض في طبق جمع البيوض. يُضاف 4 mL من معلق حيوانات منوية جُمعت حديثاً في وسط 1XMMR، ثم تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. تُغمر البيوض وتُشطف جيداً باستخدام محلول في درجة حرارة الغرفة.

يتم تحضين XMMR في درجة حرارة الغرفة للسماح بالتنشيط والتشطر. يمكن استخدام السيستين في أي وقت لإزالة الأغلفة الهلامية. بعد ذلك، يمكن فرز الأجنة المنقولة في أطباق منفصلة بناءً على اللون وزراعتها كأجنة طبيعية.

عادةً ما يتم تنشيط أكثر من ثلثي البويضات المنقولة خلال دقائق من الإخصاب، حيث تظهر انكماشاً قشرياً قوياً عند القطب الحيواني. وفي معظم التجارب، تخضع أكثر من نصف البويضات المنقولة للانقسام الأول الطبيعي. وفي بعض الأحيان، يتأخر الانقسام لمدة 20 دقيقة تقريباً مقارنةً بالبويضات المضيفة في تجاربنا.

تستمر نسبة 30 إلى 60% من الأجنة المنقولة في عملية التبرعم الطبيعية وستبقى على قيد الحياة بعد المرحلة العصبية. ستحتفظ الأجنة المنقولة بلون الصبغة الحيوية طوال أيام عديدة من التطور. وستظهر الأجنة المشتقة من الخلايا الضابطة غير المحقونة بشكل طبيعي كما هو متوقع.

على النقيض من ذلك، فإن الأجنة المشتقة من بويضات حُقنت بـ beta catine وأوليغونوكليوتيدات مضادة للمعنى، على سبيل المثال، سيكون لها مظهر مركزي. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية الحصول على أجنة من بويضات تم التلاعب بها في المزرعة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم البدء ببويضات مانحة سليمة وبالغة، واستخدام إناث مضيفة ذات بويضات عالية الجودة. كما يميل نجاح هذه الطريقة إلى الارتباط بالسرعة التي يتم بها عزل البويضات وإجراء العمليات الجراحية؛ لذا قد يتطلب الأمر بعض التدريب قبل الحصول على نتائج متسقة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.