تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح طرق التصوير الحي والقياس الكمي البسيط لتحليل مورفولوجيا الخلايا الطلائية الجنينية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تجهيز كافة الأدوات والأجهزة اللازمة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي استئصال X explan من أجنة الضفادع ووضعها في غرف مخصصة للزراعة طويلة الأمد.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في جمع صور عالية الدقة للخلايا الظهارية في الوقت الفعلي. والخطوة النهائية من الإجراء هي قياس التفاصيل المورفولوجية للخلايا الظهارية باستخدام برنامج Image J. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر مناطق الخلايا التي تم تتبعها وكثافة الغشاء من خلال المجهر البؤري عالي الدقة. مرحباً، أنا Sagar Joshi من مختبر Davidson في قسم الهندسة الحيوية بجامعة Pittsburgh.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الحي للخلايا والتحليل الكمي للخلايا الظهارية الجنينية لـ Xenos lavia. نستخدم هذا الإجراء لدراسة التغيرات في الهيكل الخلوي للخلايا في الوقت الفعلي. لذا، دعونا نبدأ.

لتحضير غرف زراعة القبعات الحيوانية، استخدم الشحم السيليكوني لإحكام غلق غرفة أكريليك مخصصة أو حلقة مباعدة نايلون صغيرة على غطاء زجاجي كبير بمقاس 45 × 50 مليمتر. أضف واحد مليلتر من 1%BSA في ثلث XMBS إلى الغرفة. قم بطلاء شظايا صغيرة من شرائح التغطية الزجاجية بنفس المحلول واتركها في الحاضنة لمدة تتراوح بين ساعتين وأربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل في درجة حرارة 4 درجة مئوية.

لتقليل التصاق الجنين X بالزجاج، اشطف الغرفة واملأها بوسط DFA، وقبل نقل الأجنة X مباشرة، اشطف شظايا غطاء الشرائح بنفس الطريقة. ثم اغمرها في طبق من مزارع DFA لأجنة تم حقنها مجهرياً في مرحلة الخلية الواحدة إلى أربع خلايا بـ mRNA المطلوب حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة في ثلث XMBS. استخدم ماصة نقل ذات فتحة مائلة لنقل الأجنة إلى طبق DFA تحت مجهر تشريحي ستيريو.

استخدم الملقط لتثبيت الأجنة لاستئصال سقف غطاء الحيوان (animal CapEx). استخدم حلقة شعر لدعم الجنين في وضعية واحدة. استخدم سكين شعر لإجراء شق صغير في القطب الحيواني.

قم بإجراء قطعات سريعة وسلسة متكررة لتوسيع الشق وإزالة الأديم الظاهر للقبعة. استأصل ثلاث أو أربع عينات (explan) بنفس الطريقة. واستخدم ماصة نقل لنقلها إلى غرفة الزرع المُعدة.

باستخدام حلقة الشعر، ضع كل X explan بحيث تكون الظهارة مواجهة لقاع الغرفة. وباستخدام الملقط، أمسك قطعة من غطاء الشريحة من مركزها.

اغمس النهايات في شحم السيليكون. ضع شظية واحدة فوق كل X explan. ثبت كل شظية في مكانها برفق باستخدام كميات صغيرة من شحم السيليكون.

مع الحرص على عدم كسر X explan باستخدام قوة مفرطة تماماً. املأ الحجرة بـ DFA وقم بتغطية الحواف العلوية للحجرة بالشحم السيليكوني. ثم أحكم إغلاق الجزء العلوي باستخدام شريحة غطاء بمقاس 24 x 40 مليمتر.

اضبط مستوى الـ DFA داخل الحجرة لتقليل الفقاعات الهوائية، واستخدم مناديل ورقية لتجفيف أي فائض. يمكن الآن استزراع نباتات X لفترة طويلة في الحجرة المختومة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع العدسة الشيئية 20x للمجهر البؤري (confocal microscope) في موضعها. ضع الحجرة التي تحتوي على عينة X على منصة المجهر، وضع أثقال موازنة صغيرة على الحجرة لتثبيتها في موضعها تحت المجهر ذو المجال المضيء (bright field).

اضبط التركيز واستخدم تحديد الموضع في المستوى العرضي (course positioning) لتصور النهايات القمية للخلايا السطحية. انتقل إلى وضع الفلورة واستخدم عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى. ولجمع صور منفردة أو مقاطع فيديو بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) للظهارة المستمدة، اضبط إعدادات الالتقاط لتحقيق أفضل صورة ممكنة.

يرجى الرجوع إلى الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على نصائح حول الضبط والتصوير. حافظ على طاقة الليزر عند أدنى مستوى ممكن. قم بالتقاط صور أو مقاطع فيديو بفاصل زمني لظهارة x explan epithelium.

راجع الجزء المكتوب من البروتوكول للحصول على مقترحات بشأن جمع البيانات. يمكن استخراج البيانات من ملفات الصور المجهرية بؤرية المسافة (Confocal) بطرق متنوعة. فيما يلي مثالان على كيفية تحليل ملفات البيانات باستخدام برنامج التحليل Image J مع إضافة bio formats.

لقياس مساحة خلية ظهارية، قم بسحب قائمة التحليل (analyze) وانقر على تعيين القياسات (set measurements). اختر أداة التحديد من شريط الأدوات وقم بتحديد محيط الخلية، ثم من قائمة التحليل، اختر الأدوات (tools)، ومن ثم مدير المناطق ذات الأهمية (ROI manager). لفتح مدير المناطق ذات الأهمية، اضغط على control t.

لإضافة المخطط التفصيلي إلى مدير مناطق الاهتمام (ROI manager)، حدد وأضف أي عدد ترغب فيه من المخططات التفصيلية من الصورة. ثم انقر فوق "حفظ" (save) لحفظ مجموعة مناطق الاهتمام في مدير مناطق الاهتمام. انقر فوق "قياس" (measure).

ستظهر نافذة النتائج الآن المساحات المقاسة لكل منطقة اهتمام (ROI). لقياس شدة غشاء الخلية، اختر أداة الخط المستقيم من شريط أدوات Image J، ثم ارسم خطاً عمودياً عبر الغشاء.

اضغط على CTRL T كما في المثال السابق. ولإضافة التحديد إلى مدير منطقة الاهتمام (ROI manager)، افتح قائمة التحليل (analyze menu) وانقر على "رسم المقطع العرضي" (plot profile) لإنشاء رسم بياني للكثافات النسبية على طول الخط. ولحفظ الرسم البياني كصورة، انقر على "حفظ" (save) في نافذة الرسم البياني الجديدة التي تظهر.

اسحب القائمة المنسدلة إلى ملف، ثم احفظ باسم. لقد عرضنا لك للتو كيفية التصوير الحي وقياس الخلايا الظهارية الجنينية من مستأصلات CapEx الحيوانية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إضافة مضاد حيوي ومضاد فطريات إلى وسط DFA. ولمنع النمو البكتيري والفطري، توخَّ الحذر الشديد عند ضغط المستأصلات تحت شرائح التغطية، لأن الضغط الزائد عن الحد المطلوب قد يؤدي إلى سحق المستأصل.

ومن المهم أيضًا تذكر ضبط الإعدادات المثالية للمجهر البؤري (confocal microscope) للحصول على بيانات صور بأعلى جودة ممكنة. هذا كل شيء، شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.