تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

في هذا الفيديو، يتم إجراء فحص عالي المحتوى قائم على الصور لتقييم التعديل بواسطة جزيئات صغيرة لمسار كيناز ماب (map kinase) الخاص بعامل نمو الخلايا الليفية في أجنة سمك الزيبرفيش. يتم تزاوج ذكور من سمك الزيبرفيش المعدل وراثياً وإناث من النوع البري في قفص تربية. تسقط البيوض المخصبة في القاع، حيث يتم جمعها ونقلها إلى طبق بتري. تُحضن الأجنة طوال الليل، ثم تُوضع في آبار فردية في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً.

تتم إضافة الجزيء الصغير BCI للتنشيط المفرط لإشارات FGF، ثم تُحضن الصفيحة لمدة ست ساعات. يتم التقاط الصور من كل بئر باستخدام قارئ صفائح بؤري (confocal plate reader) وتحليلها باستخدام خوارزمية مصممة ذاتياً تقوم برصد شدة الفلورة في تراكيب جنينية محددة. مرحباً، أنا هبة قادو من مختبر الدكتور مايكل تشانغ في قسم الميكروبيولوجيا والوراثة الجزيئية بجامعة بيتسبرغ.

مرحباً، أنا أندريا سبوك من معهد اكتشاف الأدوية بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لكم اليوم إجراءات تربية واختيار وترتيب أجنة أسماك الزيبرا للمعالجة الكيميائية. سنستخدم في طبق مكون من 96 بئراً أجنة معدلة وراثياً تعطي إشارات عن أنشطة عامل نمو الليفة الزجاجية، ومعالجة بجزيء يؤدي إلى التنشيط المفرط لهذا المسار.

سنوضح لكم كيفية استخدام منهجية الفحص عالي المحتوى للحصول على نشاط عامل نمو الخلايا الليفية وتحليله وتقديره كمياً بشكل آلي في أجنة أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً. سيسلط هذا الإجراء الضوء على تكنولوجيا المنصة لاستخدام أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً وعمليات الفحص الكيميائي عالية الإنتاجية. لذا، دعونا نبدأ.

قبل يومين من بدء العلاج، حدد ذكور أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً متماثلة الزيجوت وضعها في أحواض تزاوج فردية. أضف فواصل إلى الأحواض، ثم أضف أنثى من النوع البري إلى كل حوض واترك الأسماك في أقفاص التزاوج طوال الليل عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. وفي صباح اليوم التالي، قم بإزالة الفاصل. وبعد مرور ساعة واحدة، انقل الأسماك إلى حوض جديد وصب الأجننة في مصفاة بلاستيكية.

انقل الأجنة إلى أطباق بقطر 100 millimeter تحتوي على محلول E three، ثم حضنها عند درجة حرارة 28 °C لمدة تتراوح من ست إلى ثماني ساعات. بعد انتهاء فترة التحضين، افحص الأجنة باستخدام مجهر ستيريو. تكون الأجنة المناسبة للتجارب هي تلك التي تمر بمرحلة gas.

في هذه المرحلة، قم بإزالة أي أجنة غير ملقحة، والتي ستظل في مرحلة الخلية الواحدة. قم أيضاً بإزالة الأجنة غير القابلة للحياة التي تظهر معتمة أو مشوهة. ثم أضف محلول E three طازجاً واحضنها طوال الليل عند 28 °C.

في اليوم التالي، ضع الأجنة تحت مجهر ستيريو فلوري لفرز الأجنة المعدلة وراثياً بناءً على تماثل المرحلة وتوحيد تعبير GFP. تُظهر الأجنة في عمر 24 HPF حدوداً مرئية بين الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي مع تعبير مكثف لـ GFP وعيوناً مكتملة التكوين مع شبكيات ظهرية إيجابية لـ GFP. تكون هذه الأجنة نشطة وتتحرك وتتلوى داخل الغشاء الكوريوني باستخدام ماصة بلاستيكية رعوية.

انقل الأجنة البالغة من العمر 24 HPF واحدًا تلو الآخر إلى آبار فردية في صفيحة ذات 96 بئرًا. وباستخدام ماصة دقيقة، أزل أي محلول E three زائد من الآبار. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 200 µL من محلول E three إلى كل بئر.

بعد ذلك، أضف 2 µL من DMSO إلى جميع الآبار في العمودين 1 و12. ثم أضف 2 µL من BCL المحضر في DMSO كما يلي: 1 µM للعمودين 2 و7، و5 µM للعمودين 3 و8، و10 µM للعمودين 4 و9، و20 µM للعمودين 5 و10.

أضف 5 ميكرومولار إلى العمودين الخامس والعاشر، وأخيراً 25 ميكرومولار إلى العمودين السادس والحادي عشر. الآن قم بتغطية الطبق بورق الألومنيوم وحضنه لمدة ست ساعات عند 28 °C.

أضف 10 µL من trica إلى كل بئر لتخدير أجنة 30 HPF. ثم ضع الطبق في برنامج molecular devices image express ultra open meta express. اختر تكويناً يحتوي على عدسة Forex وبأقصى قطر لفتحة التصوير (pinhole).

قم بتكوين التركيز التلقائي لليزر للكشف عن قاع الطبق واستخدام إزاحة Z مُحددة مسبقاً ومثالية. وللكشف عن المناطق ذات الأهمية، قم بتعيين منطقة المسح كموقع واحد بأبعاد 2000 في 2000 بكسل بدون تجميع (binning). اختر نوع الطبق المناسب وليزر الأرجون بطول موجي 488 نانومتر عند أطوال موجات الإثارة والانبعاث 488 مقابل 525 نانومتر.

بعد ذلك، اختر بئراً تحتوي على جنين تمت معالجته بالمادة الحاملة (vehicle) وانقر على "البحث عن العينة" (find sample). سيقوم الجهاز بإجراء مسح للتركيز التلقائي والتقاط صورة واحدة للتأكد من دقة عملية الحصول على الصور. اختر بئراً تمت معالجتها بالمادة الحاملة بشكل عشوائي والتقط صورة لها.

إذا كانت الصورة واضحة وتظهر تعبير GFP في الرأس، فقم بوضع المؤشر فوق المناطق الأكثر سطوعاً وتحقق من أن شدة الفلورية تقع ضمن نطاق الكاميرا ذات الـ 16 بت، أي أقل من 65,000 وحدة.

كرر هذه الخطوات مع عينة تحكم أخرى بالمركبة (vehicle control) وبضعة آبار معالجة بالمركب. إذا لزم الأمر، قم بتعديل قدرة الليزر والكسب (gain) بحيث لا تتشبع المناطق الأكثر سطوعاً في صور التحكم الإيجابي. بعد ذلك، في نافذة الحصول على بيانات الطبقة والتحكم، اختر "acquire plate" لبدء مسح الطبقة.

سيقوم الجهاز تلقائيًا بالتقاط صورة واحدة لكل بئر في الصفيحة الدقيقة بالكامل وأرشفتها في قاعدة بيانات SQL server. وبمجرد انتهاء المسح، قم بتحميل الصور إلى D definition's. Developer عن طريق فتح developer مع تفعيل خيار slinger.

قم بإنشاء مساحة عمل جديدة. ثم من قائمة الملف (file)، اختر الاستيراد المخصص (customized import). بعد ذلك، انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور وافتح ملفاً نموذجياً.

اختر مرشح استيراد يتعرف على تنسيق الصور وبنية الملفات الناتجة عن منصة molecular devices image express ultra. الآن ولمعالجة الصور، افتح صورة تحكم وقم بتحميل تقنية شبكة الإدراك (cognition network technology) أو خوارزمية CNT أو مجموعة القواعد المطلوبة. تم تصميم الخوارزمية المخصصة المستخدمة هنا لتحديد الجنين والمح و الرأس تلقائياً، ولقياس سطوع ومساحة تراكيب الرأس التي تعبر عن GFP، قم بتنفيذ مجموعة القواعد حتى مرحلة الكشف عن الرأس والمح.

لضمان التعيين الصحيح لكيس المح وكالرأس، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة الكشف عن كيس المح إذا كان حجم الكيس كبيراً جداً أو صغيراً جداً. بعد ذلك، قم بتنفيذ مجموعة القواعد وصولاً إلى مرحلة الكشف عن تراكيب الرأس الساطعة. ولضمان التعيين الصحيح للمناطق التي تعبر عن GFP في الرأس، قم بتعديل مجموعة القواعد لضبط عتبة الكشف عن تراكيب الرأس كمضاعفات للشدة الدنيا حتى يتطابق الكشف عن تراكيب الرأس الساطعة مع الملاحظة البصرية.

بعد ذلك، قم بتنفيذ مجموعة القواعد الكاملة يدويًا على عدة صور تم اختيارها عشوائيًا من الأجنة المعالجة بالمركبة (vehicle) وصور الضبط الموجب من الأجنة المعالجة بـ PCI. ولتشغيل الخوارزمية على جميع صور الأطباق، حدد الأطباق المراد تحليلها واختر Analyze، ثم انتقل إلى مجموعة القواعد المُحسّنة وقم بتحليل جميع الآبار.

باستخدام جدولة المهام المتكاملة، سيتم استبعاد الآبار الفارغة أو الصور الغامضة تلقائياً من التحليل أثناء عملية المسح. تظهر خريطة احتفاظ يتم تحديثها باستمرار. ويمكن الوصول إلى كل من البيانات والصور أثناء التشغيل لإجراء الفحص البصري.

يتم حفظ البيانات الرقمية والصور المعالجة تلقائيًا. وبعد تحليل جميع الصور، يمكن تصدير البيانات إلى برامج خارجية مثل Excel أو GraphPad أو Prism. يوضح هذا الشكل صور مسح مؤرشفة من بئر تمت معالجته بـ vehicle وبئر تمت معالجته بـ BCI، مع وبدون تحليل CNT.

يتم الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر GFP المطبق في العين، والحدود الفاصلة بين الدماغ المتوسط والخلفي، والعقد الثلاثية التوائم في الأجنة المعدلة وراثياً. يُلاحظ أن كلاً من شدة GFP ونطاقات التعبير قد توسعت. وفي الأجنة المعالجة بـ BCI هنا، يظهر تأثير يعتمد على الجرعة لـ BCI على تعبير الجين المراسل GFP في الأجنة المعدلة وراثياً.

كان التركيز المطلوب لاستحثاث نصف الاستجابة القصوى أو EC 50 حوالي 12 micromolar. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تربية أجنة أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً، وجمعها، وتوزيعها في أطباق ذات 96 بئراً. لقد أضفنا تركيزات متزايدة من PCI كمحفز لمسار التأشير.

كما أوضحنا كيفية أتمتة تصوير الأجنة المعدلة وراثياً، وقمنا بتحليل الصور باستخدام خوارزمية مصممة خصيصاً تعتمد على تقنية الشبكات الإدراكية. وبفضل هذا النهج، تمكنا من قياس تأثيرات منشط جزيئي صغير لإشارات عامل نمو الخلايا الليفية بشكل كمي وتدريجي. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار الأجنة بعناية لتقليل التباين بين العينات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.