اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف جزيئات صغيرة تعمل على تعديل جوانب رئيسية من التطور والفيزيولوجيا الجنينية بشكل محدد. ويتم تحقيق ذلك عن طريق وضع عدد كبير من البويضات المخصبة في أطباق معايرة ذات 96 بئراً كخطوة ثانية. ثم تُضاف أجزاء من مكتبة من الجزيئات الصغيرة إلى الأطباق ذات الـ 96 بئراً بجانب الأجنة الموجودة في الـ 96 بئراً.

يتم فحص أطباق الآبار للكشف عن الأنماط الظاهرية التي تثيرها الجزيئات الصغيرة. وتُستخلص نتائج توضح أي الجزيئات الصغيرة تؤثر تحديداً على نمو أو فسيولوجيا الأسماك الفائقة. مرحباً، اسمي تشارلز هونغ من كلية الطب بجامعة فاندربيلت.

نقوم في مختبرنا بإجراء فحوصات كيميائية عالية الإنتاجية باستخدام أجنّة zebrafish. وتعد هذه التقنية سهلة نسبيًا ويمكن تطويعها على نطاق واسع لاكتشاف مركبات نشطة بيولوجيًا جديدة. في فترة ما بعد الظهر من اليوم السابق ليوم الفحص الكيميائي، قم بتجهيز من 10 إلى 20 حوض تفريخ لأسماك zebrafish.

ضع فاصلاً في كل خزان واملأ كل خزان بالماء من نظام تربية الأحياء المائية باستخدام شبكة نقل الأسماك، مع نقل ذكر بالغ واحد وأنثيين بالغتين إلى الحاوية الداخلية. في كل خزان تفريخ، ضع ملصقات تعريفية على الخزانات وضع غطاءً فوقها في صباح يوم الفرز. قم بإزالة الفواصل من خزانات التفريخ واترك أسماك zebrafish تتزاوج.

خلال الساعة القادمة، اترك البيض المخصب يمر عبر الشبكة الموجودة في أسفل كل حاوية داخلية. وبعد مرور ساعة واحدة، أعد أسماك الزيبر البالغة إلى خزانات التخزين الدائمة.

قم بإزالة الحاوية الداخلية وجمع البيض عن طريق تصفية المياه في كل حوض تربية باستخدام مصفاة شاي بلاستيكية. اقلب المصفاة فوق طبق بتري واشطف المصفاة برفق لدفع البيض إلى داخل الطبق. وباستخدام زجاجة غسيل تحتوي على وسط E three، يجب إزالة جميع البيض غير المخصب الذي يظهر بشكل عتيم.

باستخدام ماصة بلاستيكية disposable، يجب أن ينتج عن كل عملية تزاوج ما يقرب من 200 جنين. بعد ذلك، يتم نقل حوالي خمسة أجنة في وسط E three إلى كل بئر من أبار طبق 96 بئرًا باستخدام ماصة باستور زجاجية. وبمجرد توزيع الأجنة على طبق 96 بئرًا.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط E three من الآبار باستخدام ماصة 12 قناة، مع الحرص على عدم ثقب الأجنة. وباستخدام الماصة ذات الـ 12 قناة، أضف 250 microliters من E three.

أضف الوسط الذي يحتوي على 0.5 µg/mL من الـ canmycin إلى كل بئر بأسرع ما يمكن لتجنب جفاف الأجنة. ضع أطباق الـ 96 بئراً في حاضنة عند درجة حرارة 28.5 °C حتى تصل الأجنة إلى المرحلة المطلوبة لإضافة المركبات. في هذا البروتوكول، نبحث عن المركبات التي تعطل نمط التخلق الجنيني المبكر، وسنقوم بحضن الأجنة لمدة ثلاث ساعات أو حتى تصل أكثر من 90% من الأجنة إلى مرحلة الـ 1000 خلية، وعادةً ما يتم توفير مكتبات الجزيئات الصغيرة.

في لوحة مصدر مكونة من 96 بئراً، حيث يتم تخزين كل مركب في DMSO كمحلول مخزون بتركيز 10 millimolar، وقبل حوالي 60 دقيقة من وصول الأجنة إلى المرحلة المطلوبة، قم بإذابة عدد مناسب من لوحات 96 بئراً التي تحتوي على حصص من الجزيئات الصغيرة. دون الرقم التسلسلي أو أي رقم تعريفي آخر للوحات المصدر لتقليل التكثف على اللوحات. توضع في غرفة تجفيف تحتوي على مجفف. يميناً.

قم بتدوير الأطباق لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي مكتبي مجهز بمحول للأطباق متعددة الآبار. قم بإزالة الشريط الألمنيوم العلوي من الطبق المصدر باستخدام ماصة ذات 12 قناة، ثم خفف المركبات في الطبق المصدر إلى التركيز المطلوب باستخدام DMSO. في هذا البروتوكول، نستخدم تركيزاً نهائياً قدره 0.5 millimolar ونضيف 4.75 µL من DMSO لتخفيف طبق المخزون الذي تركيزه 10 millimolar.

عندما تصل الأجنة في طبق الـ 96 بئراً إلى المرحلة المطلوبة، استخدم ماصة ذات 12 قناة لنقل 2.5 µL من المركبات من ألواح المصدر إلى الألواح المستقبلة التي تحتوي على الأجنة. غطِّ الألواح التي تحتوي الآن على الأجنة والمركبات بالأغطية، وسجّل رقم تعريف ألواح المصدر على ألواح الأجنة. اخلط محتويات الألواح عن طريق تدويرها بلطف وضعها في حاضنة بدرجة حرارة 28.5 °C.

قم بتغطية كل لوحة مصدر تحتوي على جزيئات صغيرة غير مستخدمة بسقف من الألومنيوم، وثبتها بالشريط اللاصق، ثم ضعها في مجمد بدرجة حرارة -80 °C للتخزين طويل الأمد. قبل إجراء الفحص البصري، قم بصياغة معيار محدد لتحديد المركبات الواعدة (hit criterion). على سبيل المثال، في فحص مثبطات الجزيئات الصغيرة لبروتين four brainin المسؤول عن تطور الدماغ، قد يكون المركب الواعد هو ذلك الذي يؤدي إلى فقدان الدماغ الأمامي.

يعتبر غياب العينين مؤشراً بصرياً سهلاً لفقدان الدماغ الأمامي ولا يتطلب استخدام الفلورسنت لتقييمه في الأوقات المطلوبة من التطور. أخرج أطباق الـ 96 بئراً التي تحتوي على الأجنة المعالجة بالمركبات من الحاضنة، وافحص كل بئر تحت مجهر ستيريو؛ وعند الفرز للبحث عن المثبطات ذات الجزيئات الصغيرة لتطور الدماغ الأمامي، افحص الأطباق عند 28 ساعة لرصد فقدان العين كعلامة على تثبيط تطور الدماغ الأمامي. سجل هوية الطبق وموقع البئر لأي بئر يظهر فيه على الأقل ثلاثة من أصل خمسة أجنة النمط الظاهري المحدد. أعد طبق الـ 96 بئراً إلى الحاضنة.

أعد تأكيد فقدان العينين والدماغ الأمامي عند 48 ساعة. وبالرغم من أن الأجنة لن يكون لديها دماغ أمامي، إلا أنها ستظل على قيد الحياة لمدة أربعة أيام على الأقل. أعد تأكيد الإصابة المحتملة من خلال إعادة اختبار تأثيرات المركب بعدة جرعات؛ حيث يتم اختبار 10 أجنة لكل جرعة في 0.5 milliliters من وسط E three في طبق بتنسيق 48 well plate.

يجب أن يكون توقيت تحضير المركب لإعادة الاختبار مطابقاً لتوقيت الفرز الأصلي. ويتم تأكيد وجود "ضربة" (HIIT) عندما يتم إعادة إنتاج النمط الظاهري المستحث بطريقة تعتمد على الجرعة عند إعادة اختبار المركب. وأخيراً، يتم تحديد المركب النشط (hi) من قاعدة بيانات الجزيئات الصغيرة في المكتبة الكيميائية.

باستخدام الفرز الكيميائي البصري القائم على سمك الزيبرا، اكتشفنا جزيئاً صغيراً مثبطاً لإشارات hedgehog بناءً على تأثيره على محور الجسم. تُظهر هذه الصورة أجنة تعرضت لمثبط hedgehog وتبدي انحناءً بطنياً ملحوظاً في الذيل. وعند مرور 24 ساعة، لا تزال الأجنة نفسها التي فُحصت عند 48 ساعة تُظهر النمط الظاهري المنحني بطنياً.

تعرض هذه الصورة الجنين المعالج بالمركب مقارنة بالجنين الطافر في مسار hedgehog. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن لشخص واحد فحص ما يقرب من 400 مركب أسبوعياً في غضون بضع ساعات فقط. كما مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء البيولوجيا الكيميائية لدراسة موضوعات مثل تطور الخلايا، ومسارات إشارات الخلايا، والتطور الجنيني.

عند التعامل مع جزيئات صغيرة غير محددة الخصائص، من المهم اتباع إجراءات السلامة المناسبة وارتداء معاطف المختبر والقفازات، حيث يمكن أن تكون هذه الجزيئات غير المحددة خطيرة محتملاً.