الميكروسكوب الضوئي مبعثر استنادا فلاتر غابور ثنائي الأبعاد

يُستخدم في هذا الفيديو مجهر التشتت البصري لتقدير تفتت الميتوكوندريا كمياً أثناء الموت الخلوي المبرمج. وعلى الرغم من أن مجهر التشتت البصري لا يتطلب عادةً الفلورة في هذا البروتوكول، إلا أنه سيتم الحصول على صور فلورية لأغراض التحقق من الصحة. وبعد إعداد نظام التصوير، يتم وسم الخلايا بـ MIT tracker green ومعالجتها بـ staurosporine لتحفيز الموت الخلوي المبرمج.

يتم الحصول على البيانات الضوئية للكشف عن التغيرات في توجيه العضيات الخلوية خلال ساعتين. ويمكن قياس بداية تفتت الميتوكوندريا باستخدام بيانات التشتت الضوئي، والتي تُظهر انخفاضاً في درجة توجيه الجسيمات تحت الخلوية. ثم يتم التحقق من صحة البيانات من خلال ربط بيانات التشتت الضوئي بالمناطق الفلورية التي تحتوي على الميتوكوندريا.

مرحباً، أنا ندى بستاني من مختبر البصريات الحيوية في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتجرز. أنا روب باك من مختبر البصريات الحيوية، وأنا دين أيضاً من المختبر الحيوي. سنعرض لكم اليوم إجراءً لكمية الديناميكيات المورفولوجية دون الخلوية باستخدام طريقة لا تعتمد على الأصباغ الفلورية.

نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة التغيرات الديناميكية في البنية تحت الخلوية أثناء عملية الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). لذا، لنبدأ العمل. ابدأ هذا الإجراء بتعقيم اليدين المرتدية للقفازات باستخدام 70% ethanol.

ثم ضع محلولًا مخزونًا مُحضّرًا بتركيز 100 nano molar من miot tracker green ووسط استزراع خلايا BAEC مُدفأ مسبقًا داخل الغطاء الواقي مع إطفاء الإضاءة وتعقيم جميع الأسطح. بعد ذلك، ضع طبق استزراع مكونًا من ست آبار يحتوي على خلايا مزروعة على شرائح تغطية تحت الغطاء الواقي. باستخدام ماصة باست مرتبطة بخط تفريغ.

قم بإزالة الوسط الخلوي من الآبار. بعد ذلك، أضف فوراً 2 mL من الوسط المسمى إلى كل بئر لتسمية الخلايا والميتوكوندريا. قم بتغطية طبق زراعة الأنسجة لمنع التعرض لضوء الغرفة المباشر، وضع الخلايا بسرعة مرة أخرى في الحاضنة.

قم بالتحضين لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية بينما يتم تحضين الخلايا. قم بتجهيز الإعداد البصري أولاً بتشغيل مشبك قوس الزئبق. ثم قم بتشغيل الكمبيوتر وكاميرات المجهر والليزر، وقم بتوصيل جهاز الميكرو-مرآة الرقمي (DMD) في المشتت الدوار.

بعد ذلك، انظر من خلال عدسة المجهر العينية للتحقق مما إذا كان الإطلاق البصري محاذياً. يجب أن يكون مجال الرؤية مضاءً بشكل ساطع بضوء الليزر. لتحميل العينة، ضع قطرة إلى قطرتين صغيرتين من زيت الغمر فوق عدسة شيئية غمر زيتية 63 x بينما تكون في أدنى وضعية لها.

ثم ضع على المنصة شريحة تتكون من شبكة خطوط بفواصل منتظمة قدرها 10 micrometer تسمى gradi، وارفع الشيئية بحيث يلتقط الزيت بؤرة التركيز. بعد ذلك، قم بتركيز الحافة السداسية لمجال المكثف. توقف عندما يتم محاذاتها في إضاءة Kohler المركزية.

يجب أن تكون الحافة السداسية متمركزة في العدسة العينية وبتركيز حاد. بعد ذلك، وباستخدام مقابض ضبط موضع حاجب المجال للمكثف، قم بتمركز مجال حاجب المكثف فوق مجال الرؤية. ابدأ تشغيل مختبر IP وأدخل الإعدادات اللازمة لتشغيل الكاميرا.

تأكد من ضبط الكاميرا على وضع نقل الإطارات (frame transfer mode). قم بتشغيل أمر الحصول على التركيز (acquire focus) لبدء المعاينة المباشرة. بعد ذلك، قم بتعيين البادئة للفهرس وموقع الملف الذي سيتم حفظ الصور فيه.

بعد ذلك، ابدأ عملية تصوير RS. حدد الإعدادات الخاصة بتشغيل كاميرا cool snap. يجب ضبط وضع التوقيت (clocking mode) على الوضع العادي.

قم بتشغيل برنامج DMD. حدد "dark field iris" من قائمة السكربت (script menu). ثم انقر على تحميل (load) وإعادة ضبط (reset).

لتشغيل السكريبت يدوياً، اضبط شريط الاختيارات البصرية للمجهر في نافذة العرض على LSM. سيؤدي ذلك إلى إرسال الصورة عبر جهاز DMD في البصريات المحاذية، مع إسقاط صورة المجال المظلم على مستشعر CCD في كاميرا Cascade five 12.

يجب أن تظهر صورة المجال المظلم في المعاينة المباشرة في IP lab. إذا لزم الأمر، قم بضبط تركيز الصورة في المعاينة المباشرة. اضبط زمن التعريض ليكون مرتفعاً بما يكفي لضمان الحصول على 10,000 عدة على الأقل من الإشارة في الصورة.

بعد ذلك، التقط صورة لمجال الرؤية باستخدام أمر acquire single بعد عملية الاستحواذ. استخدم أمر save as indexed لحفظ الصورة على القرص. وتعمل صورة GTI على قياس حجم مجال الرؤية.

الآن، قم بتحريك عينة GTI بحيث تصبح خارج مجال الرؤية ويبقى الخلفية فقط مرئية. التقط صورة للخلفية للمجال بزمن تعريض كافٍ للحصول على 5,000 عدة على الأقل. ستساعد هذه الصورة في طرح الخلفية من الصور غير المفلترة.

للحصول الآن على صور مصفاة بمرشح جابور (Gabor filtered) للخلفية، قم بتحميل نص جابور البرمجي (Gabor Filter Bank script) إلى برنامج التحكم في جهاز DMD. قم بتشغيل النص البرمجي بالكامل لتخزين المرشحات مؤقتًا في الذاكرة المدمجة لجهاز DMD. قد يستغرق الأمر بضع دقائق بمجرد تخزين النص البرمجي بالكامل في الذاكرة المؤقتة.

استخدم علامات البدء والتوقف ضمن برنامج DMD لضمان تحميل مجموعة واحدة فقط من المرشحات المقابلة لمرشح Gabor Like واحد في كل مرة. قم بتشغيل البرنامج النصي (script) للحصول على صور مرشحة للخلفية. يجب أن تتغير معاينة الصورة المباشرة من المجال المظلم (dark field) إلى الصورة المرشحة.

بالنسبة لهذا المرشح، افتح نص الاستحواذ في برنامج IP lab من القرص. اضبط وقت التعرض لضمان الحصول على 2000 عدة على الأقل. وأثناء تشغيل نص DMD، قم بإلغاء المعاينة المباشرة في برنامج IP lab وشغّل نص الاستحواذ.

سيؤدي ذلك إلى الحصول على الفهرس تلقائيًا وحفظ الصورة المفلترة على القرص. بمجرد الحصول على الصورة الأولى، قم بإيقاف تشغيل السكريبت في نظام DMD. ثم احذف الأوامر المستخدمة من السكريبت.

بعد ذلك، استبدل علامات البداية والنهاية في بداية ونهاية مجموعة المرشحات التالية. كرر عملية الاستحواذ في مختبر IP حتى يتم استخدام بنك المرشحات بالكامل واستحواذ جميع الصور المرشحة وحفظها. استعد لزراعة الخلايا عن طريق توصيل كاوية اللحام على سطح طاولة المختبر وتسخين وسط L 15 إلى 37 °C.

قم بتجهيز محطة عمل باستخدام منشفة ورقية ومناديل Kim wipe لامتصاص أي وسط منسكب وللحفاظ على نظافة المنطقة. جهز عدة فتائل عن طريق تمزيق ولف مناديل Kim wipe، حيث ستُستخدم هذه الفتائل لسحب السائل عبر صفيحة الخلايا.

بعد ذلك، استخدم حامل العينات المعدني لإنشاء شطيرة الخلية. استخدم حقنة لوضع طبقة رقيقة من شحم الفراغ حول المحيط العلوي للثقب الموجود في اللوحة المعدنية المشغلة، بحيث تمتد إلى منتصف المسافة تقريبًا نحو نهايات الأخاديد على كل جانب. مرر بلطف شريحة غطاء نظيفة من الرقم واحد فوق الشحم.

اقلب الطبق وقم بوضع الشحم حول الفتحة. أطفئ أضواء الغرفة مع ارتداء قفازات فحص من نوع NI معقمة بالإيثانول. استخرج الخلايا من الحاضنة.

قم بإزالة غطاء الشريحة الذي سيُستخدم في التجربة من طبق الست فتحات. جفف غطاء الشريحة بعناية. ثم اضغط غطاء الشريحة بحيث يكون جانب الخلية لأسفل في الصفيحة المعدنية المدهونة فوق فتحة الرؤية.

تثبيت الخلايا داخل الطبق. تأكد من عدم بقاء أي فجوات هوائية، ومن أن الشحم قد شكل سدادة محكمة تمنع تسرب المياه بحيث يمكن تحميل الوسط. الآن، اقلب الطبق مرة أخرى مع إضافة 200 µL في كل مرة باستخدام الماصة.

أضف وسط L 15 المُدفأ مسبقاً إلى الشريحة الرقائقية (sandwich) عبر الأخدود الموجود بين غطاء الشريحة العلوي والصفيحة المعدنية حتى يكاد السائل أن يصل إلى الأخدود في الجانب الآخر. بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق وضع فتيلة عند الأخدود المقابل وإضافة 200 µL إضافية من الوسط باستخدام الماصة إلى الشريحة الرقائقية. سيتدفق الوسط من جانب إلى آخر بينما تقوم الفتيلة بإزالة الوسط القديم.

احرص على منع تكون أي فقاعات داخل السائل خلال هذه الخطوة. كرر هذه العملية من مرتين إلى ثلاث مرات مع استخدام فتيل جديد لكل عملية شطف. الآن اقلب الطبق مرة أخرى مع إمساكه من الحواف بحيث يتم حبس السائل في خزان الخلية.

اغمس مكواة اللحام في بيكر الـ veap لإذابة جزء منه بسرعة، بحيث يلتصق الـ veap بطرف مكواة اللحام. وباستخدام طرف مكواة اللحام، وزع الـ veap المصهور بعناية حول حواف غطاء الشريحة السفلي. استمر في عملية الغمس والتوزيع على طول محيط غطاء الشريحة، وذلك لإحكام غلقه وتثبيته بالصفيحة المعدنية.

يؤدي ذلك إلى تكوين سدادة ميكانيكية جيدة بحيث لا ينفصل الغطاء الزجاجي عن الشريحة أثناء الفحص. قم بتنظيف أي بقايا من الجزء السفلي. قم بتنظيف سطح الغطاء الزجاجي عن طريق تكوير منديل كيم وايب (KimWipe) ومسح الغطاء.

قم بتمرير الغطاء الزجاجي بحركة انزلاقية واحدة لضمان أن يكون المركز، حيث ستتم عملية الفحص، هو الأكثر نظافة. أعد اللوحة ذات الجدران الستة إلى الحاضنة. انقل الخلايا الموجودة في اللوحة إلى مختبر البصريات وقم بتثبيتها على العدسة الشيئية.

كما سبق، ابحث عن مجال من الخلايا التي تبدو سليمة والتقط صورة للمجال في وضع المجال المظلم (dark field). بعد ذلك، قم بمحاذاة المجهر في وضع تباين التداخل التفاضلي (DIC) مع التأكد من أن أوقات التعريض كافية. ثم التقط صورة DIC باستخدام كاميرا متتالية (cascade camera).

في هذا الإعداد، يتم الحصول على الصور الفلورية باستخدام كاميرا cool SNAP بينما لا يزال المجهر مضبوطاً على وضع تباين التداخل التفاضلي (DIC). اضبط متغير المجهر (VAR) على قيمة x واحدة ونافذة العرض على 100% ثنائي العينين، وقم بتحويل الصورة من العدسة العينية إلى الكاميرا. ضع صمام LED أزرق فوق المكثف لإضاءة الحقل.

بعد ذلك، عاين مجال الرؤية في صورة RSS واضبط التركيز الدقيق. إذا لزم الأمر، التقط صورة DIC واحفظها على القرص. لاحظ كيف يختلف مجال الرؤية عن ذلك الذي تم الحصول عليه من كاميرا cascade.

سيتعين تسجيل هذه الصور خلال مرحلة تحليل التجربة. بعد ذلك، قم بنقل مكعب المرشح الفلوري إلى موضعه والتقط صورة فلورية عن طريق تشغيل استثارة الفلورة لفترة وجيزة باستخدام غالق المجهر، ثم قم بإيقاف تشغيله فور اكتمال عملية الالتقاط. وللحد من التبييض الضوئي، احفظ الصورة الفلورية على القرص.

للحصول على صور مفلترة، أعد ضبط المجهر على الحقل وأرسل الضوء عبر منفذ LSM. وكما سبق، قم بتشغيل نص بنك مرشح Gabor بالكامل لإكمال عملية اكتساب البيانات لنقطة زمنية واحدة بينما لا تزال الخلايا على المنصة ودون تحريك حقل الرؤية. استخدم طريقة الامتصاص (wicking method) لاستبدال وسط L 15 العادي بوسط مماثل يحتوي على محلول STS بتركيز 1 µM.

خلال مسار التجربة، أضف وسطاً إضافياً لمنع الجفاف عن طريق سحب الوسط بالماصة ووضعه في أخدود صفيحة الخلايا دون إزالتها من المنصة أو تعكير مجال الرؤية. الآن، كرر هذه الخطوات للنقاط الزمنية اللاحقة حتى تكتمل التجربة. ستشمل البيانات التي تم جمعها عدداً كبيراً من الصور المفلترة التي يجب معالجتها لاستخراج بيانات البنية تحت الخلوية.

يتم هنا عرض تجربتين كمثال. يوضح هذا الشكل صوراً تتابعية لعينة من طحالب الدياتوم البحرية، حيث تظهر المعالم الموجهة بوضوح.

في التصوير بالمجال المظلم، تظهر الصور المرشحة بصرياً والموسومة بـ five equals 0 degrees إلى five equal 160 degrees إلى جانب الصورة غير المرشحة للعينة. وللمقارنة، تمت معالجة المجموعة المكونة من تسع صور مرشحة بمرشح Gabor للدياتوم بكسل تلو الآخر لتحديد اتجاه الجسم.

عند كل بكسل، تم تقسيم الإشارة القصوى على متوسط الإشارة كدالة في اتجاه المرشح للحصول على قيمة نسبة العرض إلى الارتفاع. وهنا، تشير نسبة العرض إلى الارتفاع القريبة من الواحد، والموضحة باللون الأزرق، إلى وجود مناطق لا يوجد فيها زاوية استجابة مفضلة. بينما تشير القيم الأعلى، والموضحة باللون الأحمر، إلى مناطق يتوفر فيها استجابة أعلى للزاوية المفضلة.

تشير شدة السطوع والدلالة الرمزية لاستجابة مرشح GABOR الكلية، وتوجه المرشح الذي يعطي أقصى إشارة عند كل بكسل، إلى الاتجاه العمودي على توجه الجسم الأساسي. يتم ترميز توجه جسيمات البنية التحتية في مخطط سهمي (quiver plot) حيث يتطابق كل خط بشكل وثيق مع توجه الجسم المحلي الأساسي المرئي في المجال المظلم غير المرشح. يوضح المخطط السهمي توجه الأجسام التي تزيد شدة استجابتها عن 10% من الحد الأقصى.

تُظهر هذه الصور المأخوذة بتقنية الحقل المظلم والمرشحات الضوئية مجالاً يحتوي على خلايا بطانية بقرية حية، وقد تم الحصول على الصور المرشحة لاحقاً كل 20 دقيقة لمدة ثلاث ساعات بعد المعالجة بمحفز الموت الخلوي المبرمج staurosporine. وهنا، يتم عرض خريطة نسبة العرض إلى الارتفاع في اللوحة العلوية والتصوير الفلوري للميتوكوندريا في اللوحة السفلية كدالة في الزمن. يمثل تدرج اللون درجة التوجه، وكما سبق، تقارن هذه المخططات الزمنية الانخفاض في درجة توجه نسبة العرض إلى الارتفاع للجزيئات في الخلايا البطانية المعالجة بـ staurosporine، وتمثل المسارات الفردية مخططات زمنية داخل خلايا مفردة.

يقتصر توجيه القطرات على مناطق الخلايا التي تتطابق مع المناطق الفلورية. وبذلك، تم تحقيق التحقق من الصحة مقابل الفلورة. وتصبح هذه العملية الآن موثقة للأرشفة.

وبالتالي، في التجارب القادمة، يمكن إجراء قياسات الميتوكوندريا عن طريق حذف خطوات التصوير الفلوري واستخدام طريقة التشتت الضوئي مباشرة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية مراقبة تفتت الميتوكوندريا أثناء عملية الموت الخلوي المبرمج باستخدام بصمات تشتت الضوء بناءً على مرشحات Gabor. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اتباع تحضيرات سليمة لنمط الحياة وضمان محاذاة ومعايرة الإعداد الضوئي بشكل جيد.

لذا، دعونا نستكشف كيفية المراقبة والتعاون باستخدام تجارب واجهة المستخدم (UI).