[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة

العام لبروتوكول التحليل الطيفي لارتباط الصورة هذا هو توفير منهجية يمكن الوصول إليها للقياس الكمي لأحداث التجميع التي تحدث على سطح الخلية. يمكن للأجسام المضادة التي ترتبط بالمستقبلات على سطح الخلية أن تمنح تأكيدا وتعديلات تجميعية. تحليلات هذه العمليات الدينامية مهمة لتوصيف أهداف الأدوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر منهجية يمكن الوصول إليها للقياس الكمي لأحداث التجميع على سطح الخلية باستخدام جهاز تصوير يسهل الوصول إليه. للبدء ، قم بزرع 10،000 خلايا سرطان البشرة A431 في كل بئر من شريحة تصوير مكونة من ثماني غرف. في اليوم التالي ، أضف 100 نانوجرام لكل مليلتر من ترابط EGF مباشرة إلى الخلايا من أجل تحفيز تراكم مستقبلات EGF.

احتضان الخلايا مع الترابط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل إصلاحها. بعد ذلك ، اتبع الكيمياء المناعية وبروتوكول الصور متحد البؤر في بروتوكول النص المصاحب ، مع إيلاء اهتمام وثيق للإعدادات المستخدمة أثناء التجميع ، وتحميل مجموعات البيانات المكتسبة في فيجي. يجب تجنب التشبع الزائد.

يجب أن تحتوي الصور النهائية على أحجام بكسل أقل من 1 ميكرون مربع. بالإضافة إلى ذلك ، التقط سطحا مستويا على السطح القمي أو القاعدي بالإضافة إلى منطقة خالية من الخلايا لتطبيع العينة لاحقا. ابدأ بتحديد منطقة غشاء سطح الخلية القمية أو القاعدية ذات الأهمية في الصورة الأولى.

حدد حجم بكسل من 2 إلى n في نطاق 256 × 256 أو 128 × 128 أو 64 × 64. ثم انتقل إلى قائمة الصور ، وحدد تكرار. بعد ذلك ، انتقل إلى التحليل ، وانتقل إلى القياسات.

احسب متوسط كثافة منطقة الاهتمام التي تم اقتصاصها. الآن ، حدد منطقة خلفية من نفس الحجم من الصورة الأصلية. قم بتكرارها كما كان من قبل.

واحسب متوسط شدة منطقة الاهتمام التي تم اقتصاصها في الخلفية. مع قياس كل من مجال الاهتمام والخلفية ، انتقل إلى المعالجة ، وحدد حاسبة الصور. ضع منطقة الاهتمام كصورة 1 وصورة الخلفية كصورة 2، وحدد طرح كعملية.

بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة العملية. انتقل إلى FFT وحدد FD Math. في مربع حوار FFT math، حدد إدخال الصور كما هو موضح هنا، وقم بتعيين العملية للارتباط.

تأكد من تشغيل التحويل العكسي. قم بتطبيع الصورة الناتجة عن طريق تحديد العملية ، والتمرير لأسفل إلى الرياضيات ، وتحديد القسمة ، وإدخال العدد الإجمالي للبكسل في مربع الحوار. بعد ذلك ، قم بالتطبيع مرة أخرى بالقسمة على متوسط كثافة المساحة المقصوصة الطبيعية مربعة.

بعد ذلك ، ارسم خطا من خلال وظيفة انتشار النقاط. ارسم ملف تعريف هذا السطر لحساب قيمة الذروة بالانتقال إلى التحليل وتحديد ملف تعريف المؤامرة. احسب المجموعات لكل منطقة حزمة عن طريق نقل قيمة الذروة إلى ورقة انتشار.

ثم قم بتعيين العناقيد لكل مساحة حزمة تساوي واحدا على قيمة الذروة ناقص واحد. من أجل معالجة الصور دفعة واحدة، يوصى بإنشاء ماكرو فيجي. هذا يسمح بتحليل متسق وسريع للصور متحدة البؤر المتعددة لتحليل التحليل الطيفي لارتباط الصورة.

لإنشاء ماكرو لتدفق عمل التحليل الطيفي لارتباط الصورة، قم بإعداد البرنامج لتسجيل كل أمر قائمة في البروتوكول. لهذا ، انتقل إلى المكونات الإضافية ، وصولا إلى marcos ، وحدد تسجيل. بعد ذلك ، ارجع إلى النافذة الرئيسية وقم بتشغيل البروتوكول الموضح في القسم السابق من هذا الفيديو.

عند الانتهاء، ارجع إلى نافذة الماكرو، وحدد إنشاء لإنشاء ماكرو. بعد ذلك ، في نافذة تحرير الماكرو ، تأكد من تحديد اللغة كماكرو LJ1. إذا لم يتم تحديده، فلن يتمكن البرنامج من التشغيل.

أخيرا ، احفظ الماكرو. تضمن وظيفة النقل البصري للمجهر ظهور الأجسام ذات الحجم الجزيئي كصور تتراوح بين 200 و 300 نانومتر في مستوى XY. من خلال تصوير حبات الفريسين ذات الدقة الفرعية بنفس طريقة الخلايا كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن حساب مساحة وظيفة انتشار نقطة المجهر.

تمثل هذه الصور خلايا سرطان البشرة A431 المحفزة وغير المحاكاة ب EGF والتي تم تصنيفها بجسم مضاد أولي سيتوكسيماب يستهدف مستقبلات EGF على سطح الخلية. تمثل المربعات الصفراء غشاء الخلية الذي يحتوي على مناطق محاصيل بأبعاد بكسل 64 × 64. تم استخدام هذه الصور لإجراء تحليل التحليل الطيفي لارتباط الصورة.

بعد تطبيع دالة الارتباط التلقائي ، يمكن قياس وظيفة انتشار النقاط باستخدام أداة الخط. يتم رسم ملف تعريف دالة الخط هذه للكشف عن قيمة الذروة. باستخدام هذه الطرق ، لوحظ أن تحفيز EGF يحفز انخفاضا بمقدار 2.56 ضعفا في مجموعات EGFR المكتشفة لكل منطقة شعاع مقارنة بالخلايا غير المحفزة.

بمجرد إتقانها ، لن يستغرق تحليل صورك متحد البؤر سوى بضع دقائق لكل صورة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم جمع نسخ متماثلة متعددة لكل حالة تجريبية باستخدام الإعدادات الموضحة في هذا البروتوكول. باتباع هذا الإجراء ، يمكن توسيع التحليل الطيفي لارتباط الصورة لاستكشاف التغيرات الزمنية لأحداث التجميع في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف حالات التجميع ذات الترتيب الأعلى باستخدام ICS لتبييض الصور أثناء التوطين المشترك لبروتينين قائم على الغشاء باستخدام منهجيات التحليل الطيفي للارتباط المتقاطع للصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حساب حالة التجميع لجزيء سطح الخلية الذي يثير اهتمامك.