الفحص التجريبي الإنبثاث

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار القدرات النقيلية للخلايا السرطانية البشرية عن طريق الحقن في الوريد الذيلي. يتم تحضير الخلايا للحقن في فئران تعاني من نقص المناعة، ثم تُحقن هذه الخلايا في تلك الفئران، والتي ستُظهر نقائل رئوية بعد شهر واحد إلى شهرين.

يتم تشريح الفئران وقياس النقائل الرئوية واستزراعها. وتشير نتائج هذا النوع من المقايسات إلى مدى انتشار النقائل لنوع معين من الخلايا السرطانية. مرحباً، أنا سونالي موهانتي من مختبر الدكتور LE في قسم الوراثة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ مقايسة النقائل التجريبية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة النقائل السرطانية. لذا، فلنبدأ.

ابدأ بخلايا نمت حتى وصلت درجة تلاقيها إلى حوالي 70%، ثم اسحب الوسط الغذائي من الطبق واغسله برفق مرة واحدة باستخدام 1X PBS. بعد ذلك، أضف 2 mL من 0.05% Trypsin. هز الطبق برفق لتسهيل انفصال الخلايا.

راقب الخلايا تحت المجهر أثناء انفصالها. أضف حجماً وافراً من الوسط الذي يحتوي على FBS لإيقاف نشاط التريبسين. ثم انقلها إلى أنبوب سعة 50 milliliter.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). وبمجرد تحديد التركيز، قم بالطرد المركزي بسرعة 200 ×g تقريبًا لمدة ثلاث دقائق دون تعريض كتلة الخلايا المترسبة للاضطراب. أزل الوسط بدقة، ثم أعد تعليق الخلايا بإضافة حجم مناسب من محلول هانكس المنظم المتوازن (Hank's balance buffer solution) أو HBSS للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 5 × 10⁶ خلية/ملل.

بعد ذلك، قم بالترشيح باستخدام مصفاة خلايا من ماركة Falcon بقطر مسام 70 micrometer. ولاستبعاد تجمعات الخلايا الكبيرة، ضع طرف الماصة مباشرة فوق المصفاة الموضوعة على أنبوب استنبات سعة خمسة milliliter. ثم قم بدفع المعلق بسرعة عبر المصفاة إلى داخل الأنبوب.

قم بعدّ الخلايا مرة أخرى باستخدام صبغة tripan blue لتحديد الحيوية. يجب أن تكون الحيوية أكبر من 90% قبل الحقن. ثم قم بالتخفيف للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 times 10 to the six cells per milliliter.

يُحفظ على الثلج. أمسك بلطف ذيل فأر ناقص المناعة واسحبه إلى داخل مقيد الفئران بحيث يكون ظهره مقابل الشق وذيله بارزاً من الفتحة الصغيرة الموجودة في الخلف. مرر الحلقة ببطء نحو الداخل على طول الشق.

بمجرد أن تلتف الحلقة حول فم الفأر، قم بتثبيتها في مكانها. يجب ألا يتمكن الفأر من التحرك بحرية، ولكن يجب أن يكون معدل تنفسه طبيعيًا. حدد مواقع الأوردة الرئيسية في الذيل.

توجد أربعة أوعية دموية رئيسية في ذيل الفأر. تقع الشرايين على الجانبين الظهري والبطني من الذيل، بينما تقع الأوردة على الجانبين الجانبيين.

اسحب 200 µL على الأقل من الخلايا المُحضّرة في سرنجة سعة 1 mL. ثبّت إبرة مقاس 30 gauge نصفية واطرد أي فقاعات هوائية. يجب أن يكون الحجم النهائي في السرنجة 200 µL.

استعد للحقن في الطرف القاصي من الذيل؛ بحيث إذا فشلت المحاولة الأولى، يمكن استخدام منطقة أقرب من قاعدة الذيل لمحاولة ثانية. بعد مسح موقع الحقن بـ 70% ethanol، اسحب الذيل بشكل مستقيم.

أمسك الطرف بالإبهام واسند نقطة الحقن بالسبابة. أدخل الإبرة في الوريد واحِقن الخلايا. تأكد من أن الإبرة والمحقنة في وضع موازٍ للوريد أثناء عملية الحقن.

وإلا، ستخترق الإبرة جدار الوعاء الدموي وسيتم حقن الخلايا في أنسجة الذيل المجاورة. اسحب الإبرة إذا تمت العملية بنجاح، حيث يجب أن يتدفق الدم من موقع الحقن.

اضغط بكرة قطنية نظيفة لتسهيل عملية تنظيف الذيل، ثم قم بجس الذيل للأعلى لدفع أي عينة متبقية إلى الدورة الدموية. حرر الفأر من أداة التقييد وأعده إلى القفص. سجل عدد تجارب الحقن وعدد الخلايا المحقونة في دفتر المختبر.

قم بتحديد حيوية الخلايا بعد الحقن. كما في السابق، توفر هذه الخطوة تأكيداً على بقاء الخلايا حية طوال عملية الحقن. في نهاية تجربة الحقن، ستنخفض حيوية الخلايا، ولكن يجب أن تظل فوق 80%. كخطوة اختيارية، قم بطرد الخلايا المتبقية مركزياً ثم اشطف الرواسب باستخدام PBS مرة واحدة.

بعد ذلك، جمد الكريات عند -80 °C لإجراء تحليلات مستقبلية مثل western blotting. ولتأكيد التعبير الجيني في حالات knockdown، قم بتشريح الفئران بعد مرور شهر إلى شهرين لتحديد مواقع النقائل. ابدأ بوضع الفأر الذي تم القتل الرحيم له على محطة التشريح.

رُش الفأر بسخاء باستخدام الإيثانول. قم بفتح القفص الصدري لكشف الرئتين والقلب. ثم استأصلهما بعناية وضعهما في محلول PBS.

تعد الرئة الموقع الأساسي لانتقال الورم لأنها تحتوي على أول سرير شعيري تصادفه الخلايا. بعد دخول الخلايا في الدورة الدموية، قم بإزالة القلب وشطف الرئتين في PBS ثم افحص كل فص من فصوص الرئة تحت مجهر تشريحي. قم بعدد النقائل الورمية التي يمكن اكتشافها على جانبي الرئة، ثم اجمع أعداد نقائل الرئة في جميع الفصوص الأربعة معاً لتحديد العدد الإجمالي لنقائل الرئة.

بعد ذلك، قم بعزل النقائل الرئوية الفردية عن طريق الاستئصال باستخدام المقص. انقل كل نقيلة إلى مصفاة خلايا بمسامية 70 micrometer وقم بتفتيتها باستخدام طرف غطاء إبرة معقم. اشطف مصفاة الخلايا بعدة ملليلترات من الوسط واجمع الخلايا التي تمر عبر المرشح.

في طبق زرع، يحتوي كل طبق على الخلايا الناتجة عن نقيلة واحدة. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام على الأقل دون أي إزعاج. في البداية، ستنمو كل من الخلايا السرطانية وخلايا الأرومات الليفية على الأطباق، ولكن تدريجياً ستنتهي خلايا الأرومات الليفية وتستبدل بالخلايا السرطانية.

إذا كانت الخلايا السرطانية تحمل أي جينات مقاومة للأدوية، يتم اختيار الخلايا باستخدام المضادات الحيوية المقابلة. بعد مرور ثلاثة أيام، تُغسل أي بقايا دم أو أنسجة موجودة في الطبق باستخدام PBS، ثم يُضاف وسط غذائي جديد. يتم تقييم نقاء الخلايا المشتقة عن طريق الصبغ المناعي باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات بشرية محددة، وهنا تم استخدام جسم مضاد لمنع التفاعل مع البروتينات البشرية (anti-human menting antibody) حتى في حالة عدم وجود اختيار دوائي. يجب أن تكون نسبة الخلايا البشرية أكثر من 99%.

يمكن الآن حقن الخلايا المشتقة حديثاً مرة أخرى في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لاختبار قدراتها النقيلة في نهاية هذا المقايسة. عادةً ما يؤدي خط الخلايا السرطانية عالي النقائل إلى ظهور العديد من النقائل الرئوية، بينما ينتج عدد قليل جداً من النقائل الرئوية عن خط خلايا سرطانية ضعيف النقائل. تُظهر هذه الصور النقائل الرئوية بعد شهرين من حقن خط خلايا الميلانوما البشرية.

3 7 5 sm. عادة ما تؤدي الخلايا المشتقة باستخدام هذه الطريقة إلى حدوث نقائل أكثر من السلالة الأصلية عند اختبارها. وباستخدام هذا المقايسة مرة أخرى، فقد عرضنا لكم للتو إجراء تنفيذ مقايسة النقائل التجريبية.

عند القيام بهذا الإجراء، من المهم جداً تذكر التأكد من حقن الخلايا في الوريد الذيلي، وليس في الأنسجة المحيطة به أو أنسجة الذيل. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.