الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص فعالية العلاج المناعي بنقل الخلايا التائية النوعية للأورام في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زرع خلايا الورم عبر حقن الوريد الجانبي للذيل في الفئران لإحداث نقائل رئوية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في علاج الفئران الحاملة للأورام باستخدام الخلايا التائية السامة للخلايا CTLs النوعية للأورام.

تتمثل الخطوة النهائية في استخدام حبر الهند كوسيلة لتصور وقياس العقد الورمية كمياً. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح الفعالية في تثبيط نمو الورم (CIE) لمختلف العلاجات من خلال قياس حجم الورم وتقدير عدد العقد الورمية كمياً. مرحباً، اسمي ماري زيمرمان وأنا عضوة في مختبر الدكتور كيفن لو في الكلية الطبية بجورجيا.

مرحباً، اسمي شيلين هو. أنا طالبة في السنة الثانية وأعمل أيضاً في مختبر الدكتور لو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق التقليدية مثل منحنيات البقاء هي أن هذا الإجراء نوعي وكمي في آن واحد. ويمكن أن تمتد تطبيقات هذه التقنيات لتشمل علاج السرطان لأنها تحاكي العلاج المناعي التبني للخلايا التائية لدى مرضى السرطان من البشر.

لذا، دعونا نبدأ. في اليوم الذي يسبق حقن الخلايا الورمية، قم بزراعة قارورة T 75 الواحدة بما يصل إلى 1 × 10⁷ من خلايا CMS4met في 10 mL من وسط RPMI الذي يحتوي على 10% مصل. وللحصول على خلايا ورمية سريعة النمو، قم بالتحضين طوال الليل عند 37 °C في يوم الحقن.

أزل الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS، ثم قم بحصاد الخلايا الورمية باستخدام 0.05%trypsin EDTA عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس دقائق. أوقف التفاعل بإضافة 10 milliliters من وسط RPMI الذي يحتوي على 10%serum. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي.

قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1300 RPM في جهاز centrifuge RT val legend لمدة ثلاث دقائق. في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة السائل الطافي، وأعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من محلول one XHB Ss طازج للغسل. ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأعد التعليق بنفس الطريقة.

قم بعدّ الخلايا الورمية باستخدام مقياس كرات الدم hemo.Cytometer. خفف الخلايا في محلول HBSS بحيث يتم إعادة تعليق الخلايا المطلوبة لكل حقنة. في حجم إجمالي قدره 100 microliters، قم بتدفئة فئران B SEA التي يتراوح عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع في دورق مغمور في ماء دافئ.

لتوسيع الوريد الذيلي، ضع الفأر في مثبت الوريد الذيلي على طاولة المختبر. استخدم محقنة دقيقة لحقن 100 microliters من الخلايا الورمية في الوريد الذيلي الجانبي. اتبع تقنية تعقيم دقيقة لتجنب حدوث عدوى بعد الحقن.

قم بالضغط الخفيف على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. أعد الفأر إلى القفص واترك الورم ينمو حتى المرحلة المطلوبة. في يوم النقل، استخدم الماصة في عملية السحب والدفع لإعادة تعليق الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا المنقاة أو CTLs التي تم تحضيرها.

كما هو موضح في النص، انقل جميع الخلايا من طبق واحد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، مع مراعاة ألا يتجاوز الحجم ثلثي الأنبوب. أدخل ماصة باستور معقمة في الأنبوب المخروطي وأضف وسط فصل الخلايا اللمفاوية أو LSM فوق الخلايا حتى يقترب الحجم الإجمالي من 14 milliliters.

احرص على عدم تعكير الطبقات. قم بإجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم المكبح لإبطاء الدوار بعد الدوران، ثم انقل الخلايا اللمفاوية التائية المركزية (CTLs) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر.

أضف HBSS بحجم 10 مليلتر تقريباً للغسل. قم بعدّ الخلايا ثم قم بتركيزها عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1300 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليقها في HBSS للوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة للحقن.

مع الحفاظ على الحجم الإجمالي لكل حقنة عند 100 microliters. استخدم نفس تقنية الحقن في الذيل كما ظهر سابقاً في هذا الفيديو. ولحقن الخلايا التائية السامة للخلايا (CTLs) في الفئران الحاملة للأورام، أعد الفأر إلى القفص واترك الخلايا التائية السامة للخلايا (CTLs) تتفاعل مع الورم.

عادةً ما يتم التضحية بالفئران لإجراء التحليل بعد 14 إلى 21 يومًا من العلاج بـ CTL. ولتحديد النقائل الرئوية بصريًا، ضع الفأر الذي تم التضحية به على ظهره فوق لوح من البوليسترين. ثبت الأرجل باستخدام دبابيس لضمان الوصول غير المعيق إلى الرغامي.

قم برش الجانب البطني بـ 70%ethanol بدءاً من منتصف البطن. استخدم المقص للقص على طول الخط الناصف عبر القفص الصدري وصعوداً باتجاه الغدد اللعابية. قم بكشف القصبة الهوائية.

استخدم الملقط لإزالة الأنسجة المحيطة بالقصبة الهوائية. مرر طرف ماصة سعة 200 microliter أسفل القصبة الهوائية مع إمساك الطرف بيد واحدة. ارفع القصبة الهوائية برفق للأعلى وبعيداً عن الجسم.

قم بتدوير المنصة بمقدار 180 درجة. استخدم حقنة سعة 50 milliliter لحقن حبر الهند في الرئتين عبر الرغامي. قم بنفخ الرئتين تماماً بالحبر حتى تشعر بمقاومة قوية.

استخدم المقص لقطع القصبة الهوائية. مرر ملقطاً تحت الرئتين ثم ارفعهما خارج جسم الفأر. اشطف الرئتين لفترة وجيزة في دورق مياه سعة لتر واحد داخل خزانة استخلاص الغازات الكيميائية.

انقل الرئتين إلى وعاء زجاجي يحتوي على خمسة ملليلترات من محلول FTI. ستظهر الأنسجة الورمية على شكل عقد بيضاء على الرئتين السوداوين. بعد بضع دقائق، يمكن الآن عدّ الأورام وحفظها في محلول FTI لفترة غير محددة.

رئات لفئران تم نقل سرطان الثدي إليها. يظهر الخط الخلوي 4T1 بقعاً بيضاء تشير إلى وجود أورام. وتظهر الفئران التي تم نقل IRF8 dominant negative immune to K79E إليها تعزيزاً في القدرة النقيلية للخلايا الورمية.

تظهر هذه الصور تحليلاً نسيجياً لفعالية العلاج المناعي عن طريق النقل التبني للخلايا التائية السامة للخلايا (CTL). أظهرت الفئران الحاملة للأورام التي حُقنت بمحلول ملحي وجود أورام متعددة بعد ستة أيام، كما تشير الأسهم. ومن ناحية أخرى، أظهرت الفئران التي حُقنت بخلايا تائية نوعية للأورام انخفاضاً في الأورام في التجربة ذاتها.

توفر المعالجة بحبر الهند طريقة أبسط لقياس فعالية النقل التبني لـ CTL. هنا، تميز العقد الورمية البيضاء الموجودة على الرئات الحاملة للأورام بوضوح بينها وبين الرئات التي خضعت بنجاح للنقل التبني لـ CTL، ويسمح عد هذه العقد بدرجة من التكميم غير ممكنة باستخدام علم الأنسجة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تدفئة الفئران لتسهيل حقن الوريد الذيلي وجعلها أكثر دقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم فعالية العلاج من خلال هذا الإجراء البسيط لقياس حجم الأورام وأعدادها. شكراً للمشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.