Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

مرحباً، اسمي ريك باسكوا، طالب في مختبر هندسة الخلايا الجذعية هنا في قسم الكيمياء وعلوم الحياة بجامعة فيرجينيا كومنولث. سأوضح في هذا الفيديو كيف يستخدم مختبرنا جهاز تدوير STO منخفض التكلفة ومصنع ذاتياً لإنشاء طبقة أحادية مرئية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات من أجل قياس واسمات سطح الخلية. ونظراً لأن العديد من البروتوكولات الكيميائية المناعية مكيفة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (h PSCs) التي تنمو كمستعمرات في شرائح الغرف، فقد تظهر مشكلات عند توصيف تعبير المؤشرات الحيوية على مستوى الخلية الفردية.

إن وجود الخلايا في طبقة أحادية لا يساعد في تحليلها بصرياً فحسب، بل قد يساعد أيضاً في تقدير كمية تعبيرها. يمكن تصنيع جهاز الساينوس سبين (sinus spin apparatus) الذي تستخدمه مختبراتنا باستخدام مواد متوفرة في معظم المختبرات، وهو لا يتطلب سوى عينة صغيرة من الخلايا ولا يحتاج إلى أي نوع من الكواشف المتخصصة. والأهم من ذلك، أنه قادر على إعادة إنتاج توزيع موثوق للخلايا المفردة بغرض الملاحظة. وفيما يلي بعض الأدوات التي ستحتاجها لتصنيع جهاز السيتوزين.

شرائح بلاستيكية، وبما أنه ليس من الضروري أن تكون هذه الشرائح نظيفة، يمكنك استخدام شرائح غرف قديمة إذا رغبت في ذلك. شرائح زجاجية منظفة مسبقاً. يجب تنظيف هذه الشرائح لأنها ستكون الموضع الذي تُشكل فيه الطبقة الخلوية الأحادية.

ورق ترشيح، يمكن استخدام أي نوع، ورؤوس ماصات دقيقة. تستخدم مختبراتنا رؤوس ماصات بسعة 1 إلى 10 µL قبل البدء في عملية التركيب. يجب أولاً عمل ثقوب في الشرائح البلاستيكية.

يمكن القيام بذلك باستخدام مثقاب كهربائي (drill press). يعتمد قطر الثقوب على حجم طرف الماصة الدقيقة (micro pipette tip)، ويجب أن يكون مساوياً تقريباً لعرض أوسع جزء من الطرف المستخدم لماصة دقيقة قياسية بسعة 1 إلى 10 µL. يجب أن يكون هذا القطر حوالي سبعة مليمترات.

تعتمد كمية الثقوب التي تنشئها في الشرائح البلاستيكية تماماً على الاستخدام المقصود منها. فبالنسبة للتلوين المناعي الكيميائي في مختبرنا، على سبيل المثال، نستخدم عادةً ثقبین، أحدهما للتلوين الإيجابي والآخر للتحكم في الخلفية السلبية. ويمكن إعادة استخدام هذه الشرائح لعدد غير محدود من المرات.

بالنسبة لورق الترشيح، قم ببساطة بقص قطعة منه وفقاً لمقاييس الشريحة البلاستيكية. استخدم فتحات الشريحة كمرجع لعمل فتحات في ورق الترشيح. يجب أن يكون حجم الفتحة في ورق الترشيح كبيراً بما يكفي لتركيب طرف الماصة الدقيقة بإحكام كما هو موضح هنا.

نحتاج بعد ذلك إلى قص العدد المناسب من رؤوس الماصات الدقيقة، بحيث يتم قص رأس واحد لكل ثقب عند منتصف طوله تقريبًا. سيعمل هذا كقاعدة للشريحة الزجاجية حيث سيتم تكوين الطبقة الخلوية الأحادية. بعد ذلك، يتم وضع ورق الترشيح فوق هذه القاعدة.

ستعمل ورقة الترشيح على امتصاص أي فائض من الوسط الناتج عن صبغ المعلق. بعد ذلك، يتم وضع الشريحة البلاستيكية فوقها لتكون بمثابة الدعامة الصلبة للجهاز. ويمكن بعد ذلك إغلاق الجوانب الأربعة باستخدام شريط لاصق منزلي عادي.

أخيرًا، يتم إدخال رؤوس الماصات الدقيقة الكاملة في الرؤوس المقطوعة من الجهاز. هذا هو الموضع الذي ستوضع فيه العينات الخلوية بعد عملية التلوين المعلق. وقد يكون من المفيد أيضًا تحديد موضع الرؤوس المقطوعة على الشريحة الزجاجية في البداية لتسهيل التعرف عليها.

يتضمن بروتوكول صبغ المعلق الكيميائي المناعي الذي يستخدمه مختبرنا أولاً حصاد الخلايا الجذعية في معلق خلوي أحادي، ويتم ذلك عادةً عن طريق الهضم الإنزيمي باستخدام trypsin أو استخدام محاليل تفكيك الخلايا غير الإنزيمية القائمة على EDTA. ثم تُنقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1 ml أو 2 ml مع وسط نموها القياسي. بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي لهذه الأنابيب عند 200 Gs لمدة أربع دقائق.

ستُستخدم سرعة الطرد المركزي نفسها في جميع خطوات الغسيل والترسيب اللاحقة. بعد ذلك، يتم سحب الوسط يدوياً، مع توخي الحذر الشديد أثناء السحب لضمان عدم تحريك كتلة الخلايا المترسبة. ثم تُغسل الكتلة بـ 1 ml من PBS مرتين، مع الترسيب وسحب السائل في كل مرة.

تتضمن الخطوة التالية تثبيت الخلايا باستخدام محلول فورمالدهيد بتركيز 4% أو كواشف PFA، والمذكورة في الشرح المكتوب المصاحب لهذا الفيديو. تُحضن الخلايا في محلول الفورمالدهيد بتركيز 4% وتُترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ويُوصى بتنفيذ هذه الخطوة قبل عملية التعليق خارج الخلية، والتلوين المخصص لاستخدام جهاز الطرد المركزي السيبرينيتي (cyto spin apparatus).

بعد ذلك، تُغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة بقايا PFA. يجب بعد ذلك حجب الخلايا لمنع التلوين غير النوعي. بعد عمليات الغسل بـ PBS في الخطوة السابقة، يتم سحب سائل الغسل وإضافة 1 ml من محلول الحجب.

بعد ذلك، يجب ترك هذا المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة تقريباً. وأثناء انتظار محلول الحجب، يمكنك تحضير الجسم المضاد الأولي عن طريق تخفيفه إلى التركيز الموصى به باستخدام محلول الحجب. يُحفظ هذا المحلول عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ترك الخلايا في محلول الحجب لمدة 45 دقيقة تقريباً، قم بطردها مركزياً ثم اسحب المحلول وتخلص منه، وأعد تعليق الخلايا في محلول الأجسام المضادة الأولية. ولأغراض الكشف عن الارتباط غير النوعي والتحكم في الخلفية، يفضل الاحتفاظ بعينة واحدة على الأقل كعينة سالبة، حيث لا يتم تطبيق أي جسم مضاد أولي عليها ويتم ببساطة إعادة تعليقها في PBS.

تُترك جميع العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريباً. وإذا رغب المستخدم في ذلك، يمكن ترك الخلايا المثبتة معلقة في محلول الجسم المضاد الأولي طوال الليل، ثم تُغسل مرتين باستخدام محلول الحجب. ويمكن تحضير محلول الجسم المضاد الثانوي أثناء عملية الغسيل.

عادةً ما تكون الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء، لذا يُفضل خفض إضاءة المختبر وتغطية جميع الحاويات المستخدمة بورق الألومنيوم، وذلك لمنع تلاشي الفلورة. يمكن دمج كواشف Antifa في البروتوكول، ولكن يجب توخي الحذر عند استخدامها لأن ذلك قد يؤدي إلى زيادة الخلفية، تماماً كما هو الحال عند تخفيف الجسم المضاد الأولي إلى التركيز الموصى به في محلول الحجب. قم بتطبيق مؤشر واحد (vis) على جميع العينات، سواء تمت إضافة الجسم المضاد الأولي إليها أم لا، وذلك بعد اكتمال عملية الغسل.

اترك هذا في منطقة مظلمة، كما هو الحال داخل وعاء، لمدة ساعة تقريبًا. اغسل الخلايا بـ 1 ml من محلول الحجب مرتين. يجب أن تكون الخلايا الآن جاهزة للتلوين النووي باستخدام صبغة DPI.

قم بتحضير محلول DPI بتخفيف بنسبة 1 إلى 10,000 في محلول PBS في البداية، واغسل الخلايا في 1 ml من محلول PBS مرة واحدة، ثم أعد تعليقها في محلول dpi، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. وبما أن DAPI حساس للضوء تماماً مثل الأجسام المضادة الثانوية، فقم بإجراء التعديلات اللازمة لمنع تبييض الفلورة. اغسل مرة واحدة باستخدام 1 ml من محلول PBS، وأخيراً، أعد التعليق.

أعد التعليق مرة أخرى في 1 ml من PBS. وبذلك يصبح المحلول جاهزاً للاستخدام مع جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin). ضع حداً أقصى قدره 100 µL من محلول الخلايا المفردة في الجزء العلوي من رؤوس الماصات الدقيقة.

ومع ذلك، يُوصى باستخدام كمية أقل لمنع الفيضان أو التقطير غير الضروري. بعد ذلك، ضع جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin apparatus) والثقل الموازن في جهاز طرد مركزي مكتبي، وقم بالتدوير بسرعة 1000 RPM لمدة أربع دقائق. بعد ذلك، قم بتفكيك جهاز الطرد المركزي الخلوي بعناية وبطريقة تقلل من احتمالية إزاحة الخلايا عن الشريحة الزجاجية.

تحقق من حدوث الترسيب باستخدام المجهر الفلوري قبل التثبيت. هذه صور التُقطت لطبقة أحادية من خلايا BG one V المصبوغة بـ SSCA four لعلامات سطح الخلية باستخدام جهاز الطرد المركزي الدوار (cyto spin). لاحظ مدى انعزال الخلايا عن بعضها البعض، مما يجعل ملاحظات وتسجيلات الخلية الواحدة أمراً ممكناً.

تكمن ميزة هذا البروتوكول في قدرته على إعادة إنتاج طبقة أحادية من الخلايا بطريقة عملية وفعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتكيف بسهولة مع أي تحليل روتيني لمزارع الخلايا الجذعية. وبناءً على ذلك، آمل أن تستفيدوا من هذا الفيديو وأن تجدوا هذا البروتوكول مفيداً في أبحاثكم الخاصة.