مزمن السالمونيلا نموذج الفأر المصاب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج فأر مصاب بعدوى السالمونيلا المزمنة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير محلول السالمونيلا. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إعطاء الفئران الستريبتومايسين عن طريق التغذية القسرية، يليه السالمونيلا أو الستريبتومايسين فقط.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في عزل السالمونيلا من براز الفئران، والكشف عن عدوى السالمونيلا في أمعاء الفئران باستخدام أطباق BL chroma. والخطوة النهائية من الإجراء هي ملاحظة وتسجيل كتلة جسم الفئران وتدوين التغيرات في الحيوية التي تلي الإصابة بالسالمونيلا. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر إمكانية إحداث عدوى السالمونيلا في أمعاء الفئران التي تم إعطاؤها السالمونيلا عن طريق التغذية القسرية.

أهلاً بكم، أنا ميشيل بي من مختبر الدكتور جونسون في قسم الطب بجامعة روتشستر. وأنا واي من مختبر صن، وأنا أيضاً من مختبر صن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنشاء نموذج كتلة مصابة بـ Alytic Lennar.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة نقل إشارات التفاعل بين البكتيريا والعائل وتكون الأورام. لذا، لنبدأ العمل. قبل البدء بالتجربة، قم بتحضير ما يكفي من أطباق وسط Luria-Bertani أو LB broth لكل سلالة من سلالات salmonella لاستخدامها طوال فترة التجربة.

يمكن تبريد الأطباق وتخزينها لعدة أشهر. بعد ذلك، قم بتحضير مزرعة السالمونيلا. أخرج أنبوباً من مخزون السالمونيلا المجمدة عند درجة حرارة -80 °C واتركها تذوب على سطح العمل لنشر السالمونيلا على الأطباق.

قم بتعقيم عروة التلقيح في لهب الموقد ثم اغمسها في المخزون البكتيري المذاب. حرك العروة ذهاباً وإياباً بشكل متعرج على الثلث العلوي من طبق LB. قم بتعقيم العروة باللهب مرة أخرى ثم أدر الطبق.

حرك الحلقة بشكل متعرج لتقطع الخطوط السابقة وتوزع البكتيريا على الثلث الثاني من الطبق. كرر هذه العملية مرة أخرى، ثم قم بتعقيم الحلقة باللهب مجدداً.

تجنب غرز الحلقة في الآجار. اترك المستعمرات لتنمو عن طريق تخزين الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius طوال الليل. إذا تم الإجراء بشكل صحيح، يجب أن ينتج طبق السالمونيلا مستعمرات منفردة في قسم واحد على الأقل.

في اليوم التالي، يتم اختيار مستعمرة واحدة من طبق LB باستخدام عود أسنان معقم أو عروة بكتيرية ووضعها في 7 mL من وسط LB في أنبوب سعة 12 mL. يتم رج الأنبوب عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس ساعات تقريباً.

استخدم 0.05 milliliters من هذه المزرعة للتلقيح في 50 milliliters من وسط LB في أنبوب Falcon. يتم التحضين عند 37 درجة Celsius بدون رج لمدة 18 ساعة تقريباً.

قم بطرد مركزي للمزرعة البكتيرية الليلية بحجم 50 milliliter في درجة حرارة الغرفة بسرعة 5,000 RPM لمدة 10 دقائق وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من محلول ملح هانك المنظم أو HBSS إلى الأنبوب لإعادة تعليق البكتيريا، أو بنسبة 100 جزء من LB إلى 3 أجزاء من HBSS. ثم أكمل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters باستخدام HBSS أو بنسبة 1 إلى 10 من LB إلى HBSS.

يتطلب كل فأر 100 µL من مزرعة السالمونيلا المخففة، أو ما بين 1×10⁶ إلى 1×10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة قبل البدء في التغذية الأنبوبية؛ ويتم سحب الماء والطعام من الفئران قبل أربع ساعات من التجربة. بعد ذلك، يتم تحضير محلول الستريبتومايسين مباشرة قبل التغذية الأنبوبية عن طريق تخفيف 7.5 mg من مسحوق الستريبتومايسين في 100 µL من HBSS. بالنسبة لكل فأر يتم حقنه، تأكد من تحضير حجم إضافي لتعويض الفاقد قبل عملية التغذية الأنبوبية للفئران.

أولاً، قم بتجهيز إبرة تغذية بـ 100 µL من محلول الستريبتومايسين. أخرج الفأر الأول من القفص لإجراء التغذية القسرية، وأمسك الفأر بحيث يكون وجهه متجهاً نحو سطح طاولة المختبر. أمسك الجلد فوق كتف الفأر بإحكام باستخدام الإبهام والإصبع الأوسط، مع سحب الرأس والرقبة باستخدام إصبع السبابة لجعل المريء مستقيماً.

وجه طرف إبرة التغذية الكروي على طول سقف الفم وباتجاه الجانب الأيمن من الجزء الخلفي من البلعوم. ثم مررها برفق إلى الأسفل داخل المريء واحقن 100 µL من محلول الستريبتومايسين. يجب ألا تشعر بأي مقاومة.

كرر هذه العملية لجميع الفئران التجريبية وفئران المجموعة الضابطة التي تخضع للتجربة. بعد مرور حوالي 20 ساعة من عملية strp de m والتغذية القسرية، وقبل أربع ساعات من التغذية القسرية بـ salmonella، اسحب الماء والطعام من الفئران التي ستتلقى salmonella عن طريق التغذية القسرية الفموية. قم بإجراء التغذية القسرية لكل فأر بنفس الطريقة السابقة، باستخدام 100 µL من محلول salmonella في HBSS.

بعد التغذية القسرية، يتم نقل كل فأر إلى قفص جديد لبدء عملية جمع البراز. وبدءاً من حوالي ثماني ساعات بعد التغذية القسرية، يتم إزالة الفضلات البرازية من القفص فور سقوطها. يتم جمع 100 milligrams من براز الفأر كعينة تجريبية.

اجمع العينات يومياً أو أسبوعياً بناءً على مدة الدراسة لإجراء تحليل السالمونيلا في المواد البرازية. انقل العينة البرازية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملل مع إضافة 1 ملل من PBS، ثم قم بالرج باستخدام جهاز Vortex بقوة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 800 RPM. انقل الراشح إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 ملل، ثم قم بالطرد المركزي عند 6,000 RPM لمدة خمس دقائق.

تخلص من الطافي وأضف 200 µL من PBS إلى الرواسب واستخدم جهاز الـ vortex لإعادة التعليق. بعد ذلك، قم بالكشف عن السالمونيلا باستخدام طبق BB l roag. استخدم من 10 إلى 100 µL من محلول المادة البرازية لكل طبق، مع توزيعها على الطبق كما هو موضح في القسم الثاني.

تظهر أنواع السالمونيلا باللون الماروني نتيجة للاختلافات الأيضية في وجود كروموجينات مختارة. قم بعد مستعمرات السالمونيلا على الطبق لمقارنة مستوى العدوى بين الفئران الفردية. في هذا الإجراء التجريبي، استخدمنا إناث فئران C 57 black six خالية من مسببات الأمراض المحددة، تتراوح أعمارها بين ستة إلى سبعة أسابيع.

تم إيقاء الفئران بعدوى السالمونيلا والستريبتومايسين بالإضافة إلى HBSS. كما تم استخدام مجموعة ضابطة من الفئران التي خضعت للتغذية القسرية بالستريبتومايسين فقط. شملت سلالات السالمونيلا المستخدمة سلالة السالمونيلا التيفية البرية، A TCC 1 4 0 2 8 S FP C، وسلالة السالمونيلا المتحورة غير الممرضة، وثلاث سلالات FPC من مختبر الدكتور جيمس ماديرا تحمل جين AAV R age المرتبط بالضراوة في بلازميد PSKW 29 منخفض النسخ. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن استعمار السالمونيلا التيفية في أمعاء الفأر.

تم قياس عدوى السالمونيلا المزمنة من خلال تحليل البراز، كما جُمعت عينات من وزن الجسم وأنسجة الأمعاء لإجراء التصبيغ المناعي الفلوري. وعادة ما يحدث فقدان في وزن الجسم ونفوق خلال أربعة أسابيع بعد الإصابة. وتظهر هنا نسب البقاء على قيد الحياة بعد أربعة أسابيع من الإصابة.

بمجرد بقاء الفئران على قيد الحياة لمدة أربعة أسابيع بعد الإصابة، تزداد أوزان أجسامها وتنخفض حالات الوفاة خلال الـ 23 أسبوعاً المتبقية. وبشكل عام، يمكن لأكثر من 65% من الفئران المصابة بسلالات السالمونيلا، FSY fsy، أو A VRA null أو fsy. A VRA heterozygote، البقاء على قيد الحياة لأكثر من ستة أشهر مع وجود عدوى سالمونيلا مستمرة في الأمعاء.

بعد العدوى الحادة، ظل الناجون حاملين لبكتيريا salmonella، والتي يمكن الكشف عنها بعد ستة أشهر من الإصابة باستخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول. يظهر تحليل الفلورة المناعية لعينات الأنسجة من أمعاء الفئران غزو salmonella للمخاطية المعوية في الأسبوع 27 بعد الإصابة. في هذه الصورة، تم صبغ النوى باللون الأزرق وتظهر بكتيريا salmonella المصابة باللون الأخضر.

كما هو موضح في مجموعة الضبط، لا يوجد تصبغ أخضر ساطع، مما يشير إلى عدم استعمار السالمونيلا. بينما يظهر في الفئران المصابة بالسالمونيلا بعد 27 أسبوعاً من العدوى تصبغ أخضر ساطع في المخاطية المعوية. وهذا يوضح استمرار عدوى السالمونيلا في الفئران التي عولجت مسبقاً بالستريبتومايسين.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية تحفيز عدوى مزمنة في نموذج الفأر. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير المزرعة حديثاً للحقن، واتباع مهارات الحقن الصحيحة، والكشف عن وجود ANA للتأكد من فعالية نموذج التجربة الخاص بكم. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.