حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل ومقارنة كسور الريبوسومات الأحادية (mono zone) والريبوسومات المتعددة (poly ribosome) من محللات الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة الخلايا المستهدفة، ثم تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحضير محلل الخلايا.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في طرد المواد المحللة مركزياً عبر تدرج السكروز. والخطوة النهائية من الإجراء هي تجزئة التدرج وتصور المجموعات الريبوسومية المختلفة من خلال تتبع الأشعة فوق البنفسجية UV. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في عملية الترجمة تحت ظروف تجريبية مختلفة من خلال تحليل ملف البوليريبوسوم.

مرحباً، أنا أنتوني إسبوزيتو من مختبر الدكتورة تيري غوس كينزي في قسم الوراثة الجزيئية والأحياء الدقيقة وعلم المناعة في جامعة ميريلاند وكلية جيه روبرت وود جونسون الطبية. وأنا ماركوس لويس، أيضاً من مختبر كينزي هنا في كلية جيه روبرت وود جونسون الطبية.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل متعدد الريبوسومات (poly ribosome analysis). نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التغيرات في تخليق البروتين الناتجة عن الطفرات أو العوامل البيئية. لذا، فلنبدأ. السكروز.

يجب تحضير التدرجات قبل يوم واحد من الاستخدام للسماح للتدرجات بأن تصبح مستمرة. اخلط الأحجام المناسبة من المحاليل المخزونية لسكروز بتركيز 7% و47% لتحضير 48 مليليتر من كل تركيز من تركيزات السكروز التالية: 7% و17% و27% و37% و47%. أضف DTT بتركيز واحد مولار إلى كل محلول سكروز للوصول إلى تركيز نهائي قدره واحد ملي مولار. ومن أجل صب التدرجات، قم بتوصيل ماصة باستا (pasta pipette) بمحقنة سعة 20 مليليتر عن طريق تثبيتها وإحكام غلقها باستخدام البارافيلم (para film).

أضف سبعة مليلتر من السكروز بتركيز 7% إلى قاع أنبوب طرد مركزي من البوليمر فائقة التراكز (polyamer ultra) بمقاس بوصة واحدة في 3.5 بوصة. بعد ذلك، أضف سبعة مليلتر من محلول السكروز بتركيز 17% أسفل المحلول بتركيز 7% عن طريق وضع طرف الماصة بالقرب من قاع الأنبوب والتقطير ببطء. يجب ألا يستغرق صب كل طبقة أقل من 20 ثانية.

كرر العملية باستخدام سبعة مليلترات من كل من محاليل السكروز بتركيزات 27% و37% و47% بعد تكوين التدرج. يجب أن تلاحظ خطوطاً واضحة بين الطبقات، مما يشير إلى حدوث أدنى قدر من الاختلاط. تُحفظ جميع التدرجات في درجة حرارة أربعة درجات مئوية طوال الليل، جنباً إلى جنب مع الدوارات والزجاجات والأنابيب التي ستُستخدم لجمع العينات.

لتحضير مستخلصات من خلايا الخميرة، ابدأ بتنمية 100 من 25 milliliters من مزرعة الخميرة حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 0.8 إلى 1. أضف cyclo heide إلى المزرعة بتركيز نهائي قدره 100 µg/mL واستمر في الرج عند درجة حرارة 30 °C لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، صب المزرعة في زجاجة طرد مركزي سعة 250 milliliter واملأها بالثلج.

يجب الاحتفاظ بجميع المكونات على الثلج بدءاً من هذه الخطوة، ثم يتم إجراء الطرد المركزي عند 8,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. أعد تعليق الراسب في 10 mL من محلول التحلل (lysis buffer) البارد والمبرد على الثلج، ثم انقله إلى أنابيب بولي بروبيلين سعة 15 mL. قم بإجراء الطرد المركزي عند 5,900 ×g لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C ثم أعد التعليق.

علّق الراسب في 0.5 milliliters من منظم التحلل (lysis buffer). انقل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، ثم أضف 0.5 milliliters من الخرز الزجاجي المبرد والمغسول بحمض البيريك. قم برج الخلايا باستخدام جهاز المازج الدوامي (Vortex) لأربع فترات زمنية مدة كل منها 32 ثانية، مع وضع الأنبوب على الثلج لمدة 30 ثانية بين كل فترة وأخرى.

ثم أضف 0.5 milliliters أخرى من محلول التحلل (lysis buffer) إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 milliliter، وقم بالطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter وقم بالطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

أخيراً، انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter. يمكن تخزين المستخلص عند درجة حرارة minus 80 °C قبل نقل المحلل إلى تدرج السكروز. ضع طرف الماصة مقابل جدار الأنبوب بالقرب من سطح التدرج، ثم أضف المحلل بلطف في طبقة فوق التدرج.

بالنسبة للتدرج بحجم 35 milliliter، يتم عادةً تحميل 500 µL من المستخلص الخلوي. وباستخدام الملقط، يتم إنزال أنبوب التدرج بعناية في دلو الدوار ذو الدلاء المتأرجحة. يتم إجراء الطرد المركزي للتدرجات عند 100,000 ×g لمدة أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C.

قبل حوالي 30 دقيقة من اكتمال عملية الطرد المركزي التي تستغرق أربع ساعات، قم بتثبيت الإبرة في ثاقب الأنابيب وتوصيل القلم بجهاز مراقبة الامتصاص والفلورة المتصل. قم بتشغيل الطاقة لجهاز مراقبة الامتصاص للسماح بالوصول إلى خط أساس مستقر قبل تحليل العينات.

يمكن الحصول على الاستحواذ الإلكتروني لملف PolyZone بسهولة في الوقت الفعلي عن طريق توصيل وحدة استحواذ البيانات DI 1 48 U. وبالنسبة لمسجل المخططات، املأ مضخة السرنجة بـ 50 milliliters من florin nuts باستخدام إعداد التدفق العكسي السريع. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء.

قم بتوصيل الخرطوم من المحقنة إلى ثاقب الأنابيب. وقم بتشغيل تدفق سائل Flo inert لفترة وجيزة بمعدل 6 مل/دقيقة في الاتجاه الأمامي. ولتفريغ الخرطوم من أي فقاعات هوائية، ضع مجموعة من الأنابيب تحت الخرطوم عند نهاية خلية التدفق لتجميع العينات المتسربة.

قم بتجهيز دلو ثلج يحتوي على تجويف مسبق التكوين لحمل أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على تدرج السكروز. عند اكتمال عملية الطرد المركزي التي تستغرق أربع ساعات، أخرج أنابيب الطرد المركزي بعناية من دوار جهاز الطرد المركزي وضعها على الثلج، مع الحرص على عدم تعكير التدرجات.

لتحليل مستخلصات الخلايا، ضع أنبوب التدرج على ثاقب الأنابيب، ثم صِل الجزء العلوي من الأنبوب بالمخرج وأحكم تثبيته. ارفع المنصة السفلية باتجاه أنبوب الطرد المركزي بحيث تخترق الإبرة قاع الأنبوب. ابدأ تدفق Florin alert في الاتجاه الأمامي بمعدل 6 milliliters per minute.

بمجرد أن يبدأ السائل في التدفق إلى الأنبوب، راقب حركة الإبرة في جهاز مراقبة الامتصاصية بالأشعة فوق البنفسجية المتصل بالنظام. وبمجرد أن تبدأ الإبرة في التحرك، قم بتشغيل حركة المخطط على إعداد سرعة 60. وعند الوصول إلى نهاية ملف الريبوسومات المتعددة (poly ribosome)، أوقف تدفق سائل Flo inert إلى أنبوب الطرد المركزي وأوقف حركة المخطط في جهاز مراقبة الفلورية والامتصاصية.

اسحب مادة Flo inert من أنبوب الطرد المركزي إلى المحقنة عن طريق بدء التدفق في الاتجاه المعاكس وبمعدل سريع، مع التأكد من عدم سحب السكروز من الأنبوب إلى المحقنة. قم بفك أنبوب الطرد المركزي من ثاقب الأنابيب، ثم اخفض الإبرة وأزل الأنبوب. يظهر هنا مخطط تمثيلي لمستخلص ريبوسومات تم تحضيره من الخميرة في وجود cyclo heide.

يتم توضيح قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تحتوي على polyribosomes والريبوسومات 60 s و 40 s. لقد قدمنا لكم للتو كيفية إجراء تحليل poly ribosome. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة، والحفاظ على برودة العينات وخلو الـ RNAs من التلوث.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.