طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط
أغسطس 28, 2016
يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة لاستخراج وتجزئة النصوص من الأنسجة النباتية على أساس عدد الريبوسومات المقلدة. يسمح بتقدير عالمي لنشاط الترجمة وتحديد الحالة الانتقالية لأنواع mRNAs محددة.
مرحبا ، أنا سيسيل. أنا أعمل في LGBP في مرسيليا. البروتوكول الذي سنصفه في هذا الفيديو هو طريقة بسيطة لعزل البوليسومات والأحاديات من الأنسجة النباتية المختلفة من أجل تحديد mRNAs التي تتم ترجمتها بنشاط ودراسة تنظيم الترجمة.
على سبيل المثال ، سنعرض لك عزل كثرة الجسيمات من شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا البالغة من العمر ستة أيام ، والعزل اللاحق للحمض النووي الريبي وتحليل النتائج. زرع البذور على الطبق واتركها يومين عند أربع درجات. ثم قم بزراعة النباتات خلال ستة أيام.
احصد الشتلات وطحنها في النيتروجين السائل. وزن 300 ملليغرام من مسحوق النبات وإضافة 2.4 ملليلتر من مخزن البوليسوم. جهاز طرد مركزي لجمع شظايا النبات وتحميل المادة الطافية على الجزء العلوي من تدرج السكروز.
ثميقوم التدرج الفائق بأجهزة الطرد المركزي بتجميعه من الأسفل إلى الأعلى مع القراءة المستمرة للOD. اسحب الكسر إلى كثرة ، أحادية اللون وجزء طافي وترسيب الحمض النووي الريبي بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي فائق ، قم بإعادة تعليق الحبيبات واستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل اللاحق. قبل أيام قليلة من إجراء التنميط متعدد الأشكال ، قم بإعداد تدرج السكروز.
قم بإعداد محلول السكروز 50 و 35 و 20٪ واحتفظ بها عند أربع درجات. صب طبقة السكروز بنسبة 50٪. قم بتجميده في فريزر 40 تحت الصفر.
بعد ست ساعات ، أضيفي طبقة 35٪ وقم بتجميدها في فريزر ناقص 40 طوال الليل. صب أول طبقة 20٪ وتجميدها. في يوم التجربة ، قم بإزالة العدد الضروري من التدرجات من الفريزر.
أضف آخر 20٪ طبقة من السكروز واترك التدرجات تذوب في غرفة باردة. تحضير العينة التي جمعناها حديثا النبات. هنا ، نستخدم شتلات أرابيدوبسيس ثاليانا عمرها ستة أيام.
احصد النباتات المجمدة بالنيتروجين السائل وطحنها جيدا. الوزن 300 ملليغرام من مسحوق النبات. أضف بسرعة 2.4 مل من محلول البوليسوم الطازج والتجانس.
ماصة المحلول في أنبوبين سعة 1.5 مل. الطرد المركزي مستخلص العصارة الخلوية. الماصة طاف.
احرص على تجنب شظايا النبات. سوف يفسدون الملف الشخصي في الخطوة التالية. قم بتحميل المادة الطافية على تدرج السكروز دون تعطيل التدرج.
ضع التدرج في دلو دوار SW 41. الطرد المركزي. لتصور ملف تعريف متعدد الجسيمات وجمع الكسر ، نستخدم نظاما بسيطا مصنوعا من أنبوب شعري يغرق في التدرج. إنه مرتبط بكوفيت الأشعة فوق البنفسجية.
إنه متصل ذاتيا بمضخة تمعجية. يسجل مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية باستمرار OD كتقدم التدرج عبر الكوفيت. يسمح مجمع الكسر بجمع جزأين من المليلتر.
نظف الكوفيت وضعه في مقياس الطيف الضوئي. قم بإزالة التدرج من الجرافة دون إزعاجه. يجب أن تتركز الكلوروفيل في الجزء العلوي من التدرج.
اغمر الأنابيب الشعرية في أسفل التدرج. ابدأ تشغيل المضخة التمعجية. يتم جمع التدرج من الأسفل إلى الأعلى ويتم قراءة OD باستمرار.
يتم جمع جزأين من المليلتر. هنا هو شكل الملف الشخصي الكلاسيكي. يتم تنفيذ ترسيب الحمض النووي الريبي باستخدام هيدروكلوريد الجوانيدينيوم والأيزوبروبانول.
أولا ، صب حجما واحدا من هيدروكلوريد غوانيدينيوم في أنبوب سعة 50 مليلتر ثم أضف الكسر. ثم أضف 1.5 حجم من الأيزوبروبانول و 50 ميكروغرام ساعي متساو. قم بترسيب الحمض النووي الريبي بين عشية وضحاها عند 20 درجة تحت الصفر.
انقل الكسور إلى أنابيب طرد مركزي فائق سعة 40 مليلتر ووازن الأنبوب مع الأيزوبروبانول. الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحبيبات في الهواء. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE الدافئ.
استخرج الحمض النووي الريبي بشكل أكبر عن طريق إجراء استخراج كلوروفورم الفينول الكلاسيكي. يظهر هنا ملف تعريف تمثيلي للعدسات المستخرجة من نبات الأرابيدوبسيس الشتلات التي يبلغ عمرها ستة أيام. تتوافق الذروة الرئيسية مع الأحادي ، الرنا المرسال المرتبط بريبوسوم واحد.
يتوافق الجزء الأول من الملف الشخصي مع الكسور متعددة الأجسام وهي mRNA المرتبطة بالعديد من الريبوسومات. تتطابق كل ذروة مع ارتباط الريبوسوم الجديد ب mRNA. يتوافق الجزء الأخير من الملف الشخصي مع ما يسمى بالجزء الطافي الذي يحتوي على الوحدات الفرعية الريبوسومية الحرة والحمض النووي الريبي.
تشكل كمية كبيرة من الوحدة الفرعية 60S كتفا بجوار القمة الأحادية. لتقييم سلامتها ، يمكن تشغيل الحمض النووي الريبي المستخرج من الكسور على هلام أراغوز كلاسيكي قبل استخدامه لمزيد من التجارب. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل البوليسومات من شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا ، ولكن أيضا من الورود الصغيرة والكبيرة وكذلك من أوراق نيكوتيانا بنثاميانا والطماطم والأرز لذلك يجب أن تعمل مع مجموعة واسعة من النباتات والأنسجة.
تتوافق الحمض النووي الريبي المنقى مع تحليل المصفوفة الدقيقة وكذلك لتحديد الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط بكسور متعددة الحدود.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل البوليزومات (polysomes) والمونوزومات (monosomes) من الأنسجة النباتية، مما يسمح بتحديد mRNAs المترجمة بنشاط ودراسة تنظيم عملية الترجمة. يركز المثال المقدم على عزل البوليزومات من بادرات Arabidopsis thaliana بعمر ستة أيام.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا النبات
- تنظيم الترجمة
- تحليل mRNA
خلفية علمية
- يعد فهم نشاط الترجمة أمراً بالغ الأهمية لدراسة التعبير الجيني.
- البوليسومات هي تجمعات من الريبوسومات التي تترجم mRNA، بينما المونوسومات هي ريبوسومات مفردة.
- توفر هذه الطريقة رؤى حول حالة الترجمة لجزيئات mRNA محددة.
- تعد Arabidopsis thaliana كائناً نموذجياً في أبحاث النبات.
الغرض من الدراسة
- لعزل البوليسومات والمونوسومات من الأنسجة النباتية.
- لتحديد جزيئات mRNA التي تُترجم بنشاط.
- لدراسة تنظيم عملية الترجمة في النباتات.
الطرق المستخدمة
- زراعة البذور في أطباق وإجراء عملية التنضيد البارد لمدة يومين.
- تنمية الشتلات لمدة ستة أيام في ظروف مثالية.
- عزل البوليسومات والمونوسومات من أنسجة النبات.
- تحليل RNA لتحديد نشاط الترجمة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للبوليسومات من بادرات Arabidopsis thaliana.
- تحديد جزيئات mRNAs المترجمة بنشاط.
- رؤى حول تنظيم الترجمة في الأنسجة النباتية.
- إثبات فعالية الطريقة في دراسة عملية الترجمة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة عملية الترجمة في النباتات.
- يعزز هذا البروتوكول فهم تنظيم التعبير الجيني.
- يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع نباتية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر تحليل ملفات البوليسوم (Polysome profiling) لقطة مباشرة للنشاط الترجمي، مما يتيح الحد من المخاطر الميكانيكية للفرضيات المتعلقة بالأهداف في اكتشافات الأدوية الحيوية القائمة على النباتات. ومن خلال التمييز بين تجمعات mRNA المترجمة بنشاط، تدعم هذه الطريقة التحقق من الأهداف والفرز المظهري في الأنظمة ذات الصلة زراعيًا. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية عند تحديد أولويات المركبات الرائدة لتحسين المحاصيل أو تطبيقات الزراعة الجزيئية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط وفرة mRNA بالمخرجات الترجمية.
- القيمة التشغيلية: توضيح نشاط المسار من خلال مقاييس ارتباط الريبوسوم.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز محفظة الأهداف من خلال تحديد الأهداف ذات الارتباط الترجمي المستدام.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لفحص المركبات في منصات التعبير النباتي.
- القيمة التشغيلية: تمكين توحيد المقايسات عبر التوصيف الكمي لـ OD260 وقابلية تكرار الكسور.
- القابلية للتوسع: دعم إعادة استخدام المنصة عبر أنسجة Arabidopsis وNicotiana والطماطم والأرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يربط بين مرحلة التحقق من الأهداف في طور الاكتشاف وتقييم المؤشرات الحيوية قبل السريرية في الأنظمة النباتية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يركز على القيمة التنبؤية من خلال عزل مجموعات mRNA المحددة بناءً على حمل الريبوسومات.
- نظام ذو صلة بالمرض: قابل للتطبيق على نماذج المحاصيل المستخدمة في الزراعة الجزيئية وإنتاج المستحضرات الصيدلانية الحيوية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر، حيث تدعم اختبار الفرضيات قبل تحديد المركبات الرائدة، وتسمح بالاستمرارية الانتقالية وصولاً إلى التقييم قبل السريري في الأنظمة القائمة على النباتات.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار مدى ارتباط الهدف عن طريق قياس التحولات في نسب البوليسوم/المونوسوم تحت الظروف التجريبية.
- الفحص: تقديم قراءات توصيف الريبوسوم التي تساعد في مقارنة تأثيرات المركبات أو الاضطرابات الجينية.
- التحليلات: توليد تتبعات كمية لـ OD260 ومحاصيل RNA مجزأة لتحليل الظروف المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: التوافق مع اكتشاف المؤشرات الحيوية في مسارات الزراعة الجزيئية للنباتات.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تأسيس قدرة على التجزئة قابلة للتطبيق عبر مختلف الأنسجة والأنواع النباتية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال تحديد حالات الترجمة لـ mRNAs المستهدفة.
- القيمة التشغيلية: يضمن إمكانية التكرار من خلال تجزيء تدرج السكروز المعياري والمراقبة المستمرة لـ OD.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقديم دليل مباشر على تعديل الهدف على مستوى الترجمة.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر بناءً على بيانات نشاط الترجمة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة النباتية وتحضير منظم البوليسوم.
- يعتمد على معدات الطرد المركزي الفائق وأنظمة جمع الأجزاء مع مراقبة الأشعة فوق البنفسجية UV.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص تحضير التدرج وبروتوكولات تجميع الأجزاء.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التوسع في الأنظمة النباتية غير النموذجية.
- ينطوي على قيود عملية تتعلق بسلامة الـ RNA أثناء خطوات التجزئة والاستخلاص.
