وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن خلايا مفردة من السومات (somites) أو الأنابيب العصبية في دجاجات (chic) ببلازميد يشفر البروتين الفلوري الأخضر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق سحب ماصات الحقن المجهري بقطر فتحة طرف مناسبة. والخطوة الثانية من الإجراء هي تحضير مخزون من البلازميد لعمليات الحقن.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحضير الأجنة للحقن. والخطوة الرابعة من الإجراء هي تعبئة الماصات الدقيقة بـ plasmid DNA. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي حقن الأنسجة المطلوبة.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر نطاق المشتقات في عدد الخلايا التي تنتجها أسلاف مُعلمة مفردة في نطاقات فرعية مختارة من الجسيدات والأنبوب العصبي عبر المجهر الفلوري المناعي. مرحباً، أنا رايل من مختبر البروفيسور هايم في قسم البيولوجيا العصبية الطبية في الجامعة العبرية في القدس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لحقن خلايا مفردة في جسيدات وأنابيب عصبية للدجاج.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة الفصل السلالي لخلايا العصبون الحسي وأنابيب العصب. لذا، فلنبدأ. لتوليد خلايا منفردة منقولة جينياً في أجنة الدجاج، ابدأ بسحب الماصات الدقيقة. نقوم بسحب الماصات باستخدام ساحب الماصات القياسي Naga PP 83 مع ضبط إعداد الحرارة على 13.5.

يجب معايرة الضبط الدقيق للوصول إلى قطر طرف ماصة يتراوح بين 8 و 10 ميكرون. نستخدم خيوطاً تحتوي على أنابيب زجاجية من بوروسيليكات بقطر خارجي يبلغ 1 مليمتر وقطر داخلي يتراوح بين 0.75 و 0.78 مليمتر. يمكنك أيضاً استخدام الماصات الدقيقة المتاحة تجارياً، والتي تفتقر إلى خيط بقطر خارجي 1 مليمتر وقطر داخلي 0.75 مليمتر.

تُحفظ الماصات المُحضرة في طبق بلاستيكي مع حماية الرؤوس من ملامسة حافة الطبق. ولتحضير DNA للحقن المجهري، يتم ترانسفكشن البلازميد المطلوب في بكتيريا DH five alpha e coli. وباستخدام الإجراءات القياسية في اليوم التالي، يتم تنقية البلازميد باستخدام طقم Maxi prep؛ وبالنسبة للحقن غير النسلية، نستخدم تركيز DNA يبلغ 1 µg/µL.

بالنسبة للتجارب التي تهدف إلى الحصول على مستعمرات منفردة، سيكون تركيز البلازميد أقل بكثير وسيتطلب تعديلاً. بالنسبة لـ P-C-A-G-G-F-P-A، فإن تركيزاً يتراوح من 0.05 إلى 0.1 microgram لكل microliter يعمل بشكل جيد. وبمجرد تحديد التركيز الأمثل، نوصي بتخفيف كامل مخزون البلازميد المُنقى بدلاً من تحضير عينات فردية للوصول إلى تركيز محدد مسبقاً.

قد يؤدي الأمر الأخير إلى إحداث بعض التباين في معدلات النجاح، ويرجح أن يكون ذلك بسبب الاختلافات في درجة النقاء ومعايير أخرى، مثل نسبة البلازميد فائق الالتفاف. ولتحضير بيض الدجاج للحقن المجهري، يتم مسح البيض الذي تم حضنه وهو مستلقٍ على محوره الطولي حتى الوصول إلى المرحلة التنموية المطلوبة بـ 70%ethanol ثم يُترك ليجف. بعد ذلك، يتم ثقب الطرف المدبب للبيضة باستخدام مقص جراحي. وباستخدام سرنجة سعة 10 milliliter وإبرة قياس 19 gauge، يتم سحب 2 milliliters من الألبومين من البيضة، ثم تُسد الثقوب باستخدام البارافين الساخن قبل عملية الحقن.

استخدم مقصاً جراحياً لفتح نافذة في الجزء العلوي من قشرة البيضة لمنع دخول الحطام إلى الثقب. ضع قطعة من الشريط اللاصق فوق النافذة ثم اصنع ثقباً من خلالها. للمساعدة في تصور الجنين، استخدم شعيرة مسحوبة حرارياً مثبتة على جهاز شفط لحقن حبر غير سام مثل pelican 17 أسفل الأدمة المنفجرة.

بعد ذلك، يتم الوصول إلى الجنين عن طريق قطع وتحويل الأغشية الحيوية و/أو السلوية باستخدام دبابيس حشرات بقطر 0.14 millimeter مثبتة على حامل إبر لتحميل الـ DNA في ماصة Eloqua المسحوبة، وإضافة كمية صغيرة من مسحوق fast green باستخدام الشعيرة. يتم سحب كمية ضئيلة من البلازميد باستخدام شعيرة مثبتة ذات قطر مناسب بواسطة جهاز شفط. ثم يتم إدخالها في نهاية الماصة المقابلة للطرف المدبب، وتحميل الـ DNA في أقرب نقطة ممكنة من الطرف المدبب.

بعد ذلك، ثبّت الماصّة على محقن ضغط هواء يدوي مثبت على مناول دقيق. طبّق قدراً ضئيلاً من الضغط إذا لزم الأمر للسماح لمحلول البلازميد بالوصول إلى طرف الماصّة. حرّك الماصّة داخل الوسط السائل للبيضة مع تطبيق بعض ضغط الهواء لمنع انسداد طرف الماصّة.

بمجرد اختراق النطاق النسيجي ذو الصلة، غالبًا ما يكون التغير في الضغط كافيًا لتحرير البلازميد المصبوغ بصبغة fast green المرئية. إذا لم يحدث ذلك، يتم تطبيق ضغط خفيف على المحقنة حتى يتم دفع خليط البلازميد وfast green. تكرر هذه العملية على طول محور الجنين، ويمكن إضافة PBS بعد الحقن.

أخيرًا، قم بإغلاق النافذة باستخدام شريط لاصق وأعد البيض إلى الحضانة. تجنب التهوية وضع حاويات صغيرة من الماء داخل الحضانة للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة وزيادة الإنتاجية. إذا كان موقع الحقن المستهدف سطحيًا بما يكفي ليكون واضحًا بسهولة، كما هو الحال داخل الأنبوب العصبي للجسيدات الظهرية أو الأديم الظاهر، يمكن قياس معدل نجاح التجربة عن طريق إجراء ملاحظة للجبل الكامل باستخدام مجهر فلوري ثنائي العينات.

تعد هذه الخطوة مفيدة بشكل خاص لتقييم ما إذا كان عدد الخلايا التي تم وسمها كثيراً جداً أو قليلاً جداً. في حال الرغبة في إجراء تحضين إضافي، أضف محلول PBS المحتوي على مضادات حيوية إلى البيضة بعد الفحص وأعد وضع شريط التثبيت العلوي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم معدل نجاح الحقن عن طريق إجراء تقطيع تسلسلي للأجنة وتطبيق الكيمياء النسيجية المناعية.

بعد مرور أربع ساعات أو أكثر من عملية الحقن، يتم تثبيت الأجنة ومعالجتها لعمل مقاطع شمع البارافين. بعد ذلك، يتم إزالة شمع البارافين من المقاطع المثبتة على شرائح زجاجية وتصبيغها مناعياً لتصور المراسل، وقد تكون طرق التضخيم مثل البيوتين والستربتاديفيدين مرغوبة. وأخيراً، يتم مسح المقاطع المتسلسلة ضوئياً للكشف عن الخلايا المحددة في الأجزاء المحقونة.

إذا تم الحصول على خلايا متعددة بدلاً من خلية واحدة خلال التجارب الأولية، فيجب تخفيف مخزون البلازميد وتكرار العملية حتى يتم تحقيق النتائج المرجوة. نقوم عادةً بإجراء حقنة واحدة من P-C-A-G-G-F-P لكل قطعة جلدية (somite) مع استهداف ست إلى 12 قطعة في كل جنين. وفي ظل هذه الإعدادات، يمكن اكتشاف إشارة واضحة عن طريق الملاحظة الكلية (whole mount observation) بعد ثماني ساعات من الحقن في قطعة واحدة على الأقل في جنين واحد من أصل 10 أجنة.

في هذا المثال، تم حقن ميريت (somite) بپلازميد يشفر لبروتين GFP، وبعد خمس ساعات لوحظت خلية فلورية واحدة في عرض شامل للجنين موضح هنا. وعند الفحص بعد 24 ساعة من الحقن في الميريت المركزي، لوحظت مستعمرة من الخلايا الفلورية في جنين تم عرضه بشكل شامل بعد يومين من الحقن النسيلي. ويكشف تقطيع هذا القطاع عن وجود نسل نسيلي في كل من الأدمة والعضلات، مما يثبت أن السلف الواحد ينتج كلا المشتقين.

أما بالنسبة للجسيدات، فيمكن أيضاً وخز السلائف العصبية الظهارية المفردة في الأنبوب العصبي الظهري كما هو موضح في هذا المقطع العرضي، الذي تم تصويره هنا بعد خمس ساعات من الحقن. وقد كشف تحليل المقاطع المتسلسلة أنه تم تحقيق ترانزفكشن نسيلي عندما كان معدل النجاح حوالي 10%، وهذا يعني أنه من أجل تحقيق النسلية، فإن التقنية تكون بطبيعتها غير فعالة للغاية. من ناحية أخرى، وفي ظل هذه الظروف، وجد أن أكثر من 93% من أحداث الوسم الإيجابية كانت نسلية.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية حقن خلايا مفردة من أجنة الدجاج عند إجراء هذا الإجراء. ومن المهم تذكر تخفيف كمية كبيرة من البلازميد المخزون للوصول إلى التركيز المثالي لإصابة الخلايا المفردة، ومن ثم استخدامه في جميع تجاربكم. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.