تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف التجمعات البروتينية الكبيرة باستخدام قياس الطيف الكتلي البنيوي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شعيرات مطلية بالذهب للتأين بالرش الكهربائي بتدفق نانوي. وكخطوة ثانية، يتم تحضير العينة ومعايرة مطياف الكتلة لقياسات الكتلة العالية.

بعد ذلك، يتم تحسين الظروف التجريبية من أجل الحفاظ على سلامة المعقدات البروتينية في الطور الغازي. ثم يتم الحصول على أطياف MS و tandem MS. وأظهرت أطياف MS حالات شحنة تتوافق في الكتلة مع المعقد السليم، بينما أسفرت تجارب tandem MS عن نمط ارتباط للمونومرات والمعقدات المجردة.

مرحباً، أنا نام كيبا من مختبر ميرون في معهد وايت مان للعلوم، وأنا إسحاق كي، وأنا أيضاً من مختبر ميرون. نود اليوم أن نعرض لكم الإجراء الأساسي لتحليل المعقدات البروتينية الكبيرة باستخدام قياس الطيف الهيكلي، ونحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتوصيف المعقدات البروتينية لتحديد هندستها الموضعية، وتكوينها، وشبكات التفاعل الخاصة بها. لذا، دعونا نبدأ.

يتم إجراء تحليل المعقدات البروتينية المرتبطة غير التيارية باستخدام تقنية التحصين بالرش الهوائي باستخدام شعيرات as emme plus أو a qua. يمكن سحب هذه الشعيرة C للحصول على طرف دقيق يبلغ قطره حوالي 1 micron ثم تُطلى بمادة موصلة مثل الذهب. هذه الشعيرات متوفرة تجارياً كما ترون هنا.

ومع ذلك، فإن استخدامه أكثر فعالية من حيث التكلفة. أما الشعيرات الزجاجية، التي يمكن تبريدها وطلاؤها لتصبح جاهزة للاستخدام، فيتم تبريدها باستخدام جهاز تبريد الإبر هذا، وطلاؤها باستخدام جهاز الطلاء هذا. لبدء هذا الإجراء، قم بتثبيت شريطين من وسادة لاصقة مزدوجة الوجه في قاع طبق بتري، مع ترك مسافة 2 cm بين الشريطين.

ضع قضيبًا زجاجيًا في مركز إحدى الوسادات. تعمل الوسادة اللاصقة على تثبيت الشعيرات في مكانها، بينما يقوم القضيب الزجاجي بدعم الشعيرات المُحضرة ويمنع تكسر أطرافها. استُخدمت شعيرات زجاجية من نوع بوروسيليكات بقطر خارجي يبلغ 1 millimeter وقطر داخلي يبلغ 0.78 millimeter.

أدخل أنبوباً شعرياً واحداً في الإبرة، وثبّت الأنبوب الشعري برفق في مكانه واضبط موضعه بحيث يستقر في مركز الفتيل الحراري. أحكم ربط المشابك برفق حتى يتم تثبيت الأنابيب الشعرية بإحكام من كلا الطرفين. اسحب الأنبوب الشعري باستخدام البرنامج المحدد مسبقاً الموضح هنا.

ومع ذلك، تذكر أن عملية برمجة جهاز السحب تعتمد على التجربة والخطأ. فحتى يتم الحصول على شكل طرف مقبول، تؤدي كل شعيرة يتم سحبها إلى إنتاج شعيرتين نهائيتين مشكلتين. قم بإزالة الشعيرات المسحوبة من الجهاز وافحص الأطراف، مع التخلص من أي شعيرات مشوهة أو مكسورة.

استخدم ملاقط تثبيت غير حادة لوضع الشعيرات في طبق بتري. بحيث تكون قاعدة الشعيرات مثبتة على الوسادة اللاصقة والجزء العلوي مستنداً إلى القضيب الزجاجي مع توجيه الطرف للأعلى. استمر في سحب الشعيرات حتى يمتلئ طبق بتري.

يتسع طبق بقطر 10 سنتيمتر لنحو 80 شعيرة دموية. بعد ذلك، يتم طلاء الشعيرات بالذهب. أدخل الطبق في جهاز الطلاء بالترذيذ الذهبي.

تأكد من اختيار مصدر إمداد الغاز وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتفعيل دورة طلاء محددة مسبقاً. تُكرر عملية الطلاء من ثلاث إلى ست مرات حتى تكتسب الشعيرات لوناً ذهبياً متساوياً. بمجرد أن تصبح الشعيرات جاهزة، انتقل إلى معايرة مقياس طيف الكتلة.

يتم إجراء معظم التجارب التي تُجرى على معقدات MultiPro باستخدام مطياف كتلة رباعي القطب بزمن طيران بالترذيذ الإلكتروني مثل هذا الجهاز، مع وحدة إدخال من شركة Waters معدلة للكتل العالية. قبل تحميل عينة البروتين، قم بمعايرة مطياف الكتلة باستخدام يوديد السيزيوم.

أولاً، قم بتحضير محلول من السيزيوم بتركيز 100 mg/mL في ماء منقى؛ حيث يُستخدم السيزيوم لمعايرة الكتلة العالية، نظراً لأن العناقيد الملحية أحادية الشحنة تمتد عبر نطاق كتلي واسع يبدأ من نسبة كتلة إلى شحنة تبلغ 393 وصولاً إلى ما يزيد عن 10,000. وباستخدام ملقط غير مدبب، خُذ شعيرة مطلية من طبق بتري، ثم حمّل 2 µL من محلول السيزيوم داخل الشعيرة.

باستخدام طرف محمل به هلام (gel) من نوع einor. قم بتحريك المحلول نحو طرف الشعيرة، إما يدوياً أو باستخدام محول طرد مركزي (spin down adapter). أدخل الشعيرة في حامل الشعيرات واضبطها بحيث يكون الطرف بعيداً عن حافة الحامل بمسافة 10 millimeters تقريباً.

ضع الشعيرية تحت مجهر ضوئي واستخدم ملقطاً حاداً من النوع AA لتقليم الطرف. من المهم التحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل الشعيرية قد تعيق التدفق وأن الشعيرية ليست مسدودة. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من عدم تقشر الطلاء الذهبي من الشعيرية.

إذا كان الأمر كذلك، فاستبدل الشعيرة أو قم بتقليم الطرف وإزالة الجزء غير المطلي. بعد ذلك، قم بتوصيل حامل الشعيرة بواجهة ESI للتدفق النانوي. قم بتدوير منصة XY و Z للخلف لتجنب إتلاف الشعيرة، ثم ادفع المنصة إلى وضع التنشيط.

يجب وضع الأنبوب الشعري على مسافة تتراوح من 1 إلى 10 مليمتر من فتحة المخروط. يتم تطبيق الجهد الشعري وضغط تدفق نانوي منخفض حتى يبدأ الرش. بعد ذلك، حاول تقليل ضغط التدفق النانوي إلى أدنى قيمة ممكنة.

قم بتحسين كثافة الإشارة من خلال ضبط موقع منصة XYZ، وجهد الشعيرة، وضغط التدفق النانوي، وتدفق غاز إزالة المذيب. وللكشف عن نطاق واسع من الكتلة لسلاسل القمم الموسمية، يجب تحسين جهود التسريع. والمعلمات المستخدمة هنا هي: جهد الشعيرة من 1.3 إلى 1.7 kilovolts، ومخروط العينة من 80 إلى 150 volts، ومخروط الاستخلاص من one إلى three volts لتحسين انتقال الأيونات ذات الكتلة العالية، والتي تتطلب ظروف إزالة مذيب رقيقة.

يتم رفع ضغط الدعم إلى ما بين خمسة إلى ستة millibar في مرحلة الفراغ الأولية بين المصدر والمحلل. ولرفع ضغط الدعم، قلل بعناية من موصلية خط فراغ المصدر المؤدي إلى مضخة التمرير (scroll pump) عن طريق إغلاق صمام العزل جزئياً مع مراقبة التأثير على كثافة الإشارة. عند اكتمال إعداد أجهزة مطياف الكتلة، اجمع حوالي 30 مسحاً بمعدل مسح واحد في الثانية ضمن نطاق نسبة شحن رئيسية تتراوح بين 1000 إلى 15,000، وبعد عملية الاستحواذ، قم بمعايرة زمن الطيران باستخدام جدول المعايرة المناسب.

بعد اكتمال عملية المعايرة، يمكن الآن تحميل عينة البروتين. يتم تحضير العينة قبل معايرة مطياف الكتلة، حيث يتطلب الأمر تركيزات منخفضة بالميكرومولار. إذا لزم الأمر، قم بتركيز العينة باستخدام أجهزة الترشيح الفائق بالطرد المركزي.

تحقق من عدم امتصاص المعقد البروتيني إلى غشاء الجهاز قبل الاستخدام. نظرًا لأن المحاليل المتطايرة فقط هي التي يمكن استخدامها في تقنية NESI من خلال فحص الحجم والامتصاص فوق البنفسجي (UV)، فإن ذلك يجعل عملية تبادل المنظم (buffer exchange) ضرورية في كثير من الأحيان. يمكن استخدام عمود ترشيح هلامي بالطرد المركزي الدقيق لإزالة جميع آثار الأملاح، أو جزيئات المنظم، أو أي نواتج إضافة غير متطايرة أخرى.

بدلاً من ذلك، قم بتعليق العينة في محلول مائي من خلات الأمونيوم. تحدد هذه الخطوة الحاسمة جودة الأطياف.

كرر عملية استبدالBالمنظم حتى ثلاث مرات مع تقليل التخفيف إلى أدنى حد، بحيث يكون أقل من عامل 1.3 لكل جهاز حتى يتم تحقيق أقصى استبدال. في حال تطلب الأمر تركيز العينة واستبدال المنظم معاً، يمكن القيام بذلك من خلال الترشيح الفائق بالطرد المركزي كما تم توضيحه في بداية هذا القسم. بعد ذلك، قم بتحميل العينة كما هو موضح في معايرة يوديد السيزيوم وابدأ عملية الرش.

ابدأ بالتحسين الأولي للرش حتى يتم اكتشاف الإشارة. استخدم معادلة حالة الشحنة المتوسطة الموضحة، حيث تمثل M كتلة المعقد. ومع ذلك، فإن الموضع الدقيق لحالات الشحنة بالدالتون يعتمد على البروتين.

لمنع تفكك المعقد، لا تقم بتسخين مصدر الحديد. إما أن تقوم بإيقاف تشغيل السخان أو الحفاظ على درجة الحرارة أقل من 40 °C. قم بتغيير موضع الشعيرية وجهد مخروط العينة والمستخلص.

لتحقيق أقصى قدر من نفاذية الحديد، يمكن البدء بضبط جهد المخروط (cone voltage) عند 100 فولت، وجهد مخروط الاستخلاص (extractor cone) عند 1 فولت، وجهد الشعيرية (capillary voltage) عند 1.5 kilovolts. تحقق من التغيير الناتج في الأطياف. قم بتحسين هذه المعلمات بالتزامن مع ضغط التدفق النانوي (nano flow pressure) لتحسين عملية التأين وإزالة بقايا الماء ومكونات المحلول المنظم.

ارفع جهد الانحياز في ضغط الغاز داخل خلية التصادم. وتكون جهود الانحياز النموذجية في نطاق يتراوح من 10 إلى 100 فولت مع تدفق غاز الحبس بمعدل 1 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية لمنع ارتباط المعقد، ثم اضبط طاقات تصادم الحبس والنقل.

غالباً ما يلزم استخدام جهود كهربائية أعلى، تتراوح عادةً بين 10 و30 فولت، لنقل الأيونات ذات الكتلة العالية. وفي هذه المرحلة، من المهم تجنب التفكك المستحث بالتصادم للمعقد كما هو موضح هنا. وبعد الوصول إلى إشارة مستقرة، يُوصى بتقليل ضغط التدفق النانوي وجهد الشعيرية إلى أدنى القيم الممكنة مع الحفاظ على استقرار الرش.

بعد جمع عدة عمليات مسح، انتقل إلى تحديد مكونات المعقد باستخدام مطيافية الكتلة الترادفية. وبمجرد الحصول على إشارة مثالية ومستقرة للمعقد البروتيني، اختر أيوناً سابقاً وحدد مركز الكتلة ضمن عرض العزل. وبشكل عام، يتم استخدام دقة كتلة منخفضة تبلغ 12 ودقة كتلة عالية تتراوح بين 13 و15، مع استخدام نطاق كتلة واسع للكشف عن نواتج التفكك ذات الكتلة العالية والشحنة المنخفضة، ثم تقليل هذا النطاق إلى القيم المطلوبة لإجراء ms.

يعمل مطياف الكتلة (MS) على تفكيك السلائف الحديدية عن طريق زيادة طاقة التصادم (المشار إليها اختصاراً بـ CE) والضغط في خلية التصادم. قم بزيادة طاقة التصادم في المصيدة أو في وحدة النقل تدريجياً وبخطوات تتراوح بين 10 إلى 20 فولت، وارفع ضغط غاز التصادم إلى ما بين 0 إلى 5 ملليلتر في الدقيقة. راقب التغيرات في الأطياف حتى يتم الوصول إلى ظروف التنشيط المثلى. قد تؤدي طاقة التنشيط العالية إلى تحفيز تفكك وحدة فرعية واحدة أو أكثر من المعقد السليم، مما يوضح ألفة التفاعل لمختلف الوحدات الفرعية.

اختر أكثر من شحنة واحدة لتحليل ms MS. في حالة تداخل المكونات، يساعد الحصول على مجموعة من أطياف MS الترادفية في فصل سلاسل الشحنات للمجموعات المختلفة. علاوة على ذلك، فإن حالات الشحن الأعلى تتفكك بسهولة أكبر مقارنة بحالات الشحن الأدنى؛ قم بدمج أطياف MS و ms.

أطياف الكتلة (MS) للتحقق من عزل أيون السلف المختار. بالإضافة إلى توصيف المعقد السليم بواسطة MS و ms. حيث ينتج MS معقدات فرعية أصغر ومحاليل تحت ظروف تمسخ خفيفة، ويتم توصيف هذه المعقدات أيضًا.

يشكل تحليل MS و ms MS للمجمعات الفرعية الأساس لتحديد البنية الوظيفية للوحدات الفرعية للمجمع؛ ولإحداث تفكك جزئي في التفاعلات بين الوحدات الفرعية، يتم إضافة المذيبات العضوية تدريجياً حتىما يصل تركيزها إلى 50%، أو تغيير pH المحلول عن طريق إضافة الأمونيا أو حمض الفورميك حتىما يصل تركيزها إلى 4%. وأخيراً، لتحديد كتل الوحدات الفرعية الفردية التي يتكون منها المجمع، من المهم الحصول على الطيف تحت ظروف مسخنة. يمكن إجراء ذلك باستخدام zip tip C four بنسبة مياه إلى أسيتونتريل تتراوح بين 25 إلى 75 مع استخدام حمض الفورميك بتركيز 1% كمذيب شطف. وبعد جمع كافة البيانات، يتم معالجة النتائج وتحليلها كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب المرفق. وقبل تحميل عينة المجمع البروتيني، يتم معايرة أجهزة مطياف الكتلة باستخدام يوديد السيزيوم.

تمتد سلسلة القمم المتباعدة بالتساوي والمحددة باللون الأحمر عبر نطاق واسع من نسبة شحنة رئيسية تبلغ 393 إلى ما يزيد بكثير عن 10,000. وقد تم تعيينها لعناقيد ملحية أحادية الشحنة ذات تركيب عام من معقد السيزيوم plus. أما الإشارات الإضافية الموجودة بين القمم الرئيسية والمحددة باللون الأسود، فناتجة عن أنواع مزدوجة وثلاثية الشحنة من سلسلة معقد السيزيوم two plus ومعقد السيزيوم three plus.

يعد زيادة الضغط في مرحلة التفريغ الأولية أمراً ضرورياً للكشف عن العناقيد ذات الكتلة العالية. يتم هنا توضيح تأثير الضغط على قمم الكتلة العالية باستخدام قراءات ضغط عكسية تبلغ 1.2 و 5.3 millibar. ويظهر هنا طيف الكتلة للضغط الأعلى بشكل موسع.

هذا مثال على مطيافية الكتلة لمعقد متغير من الليكتين، مما أدى إلى توزيع حالة الشحنة بين 3000 و 5,000 من نسبة الشحنة الرئيسية. ومع ذلك، وبسبب عدم كفاية إزالة الملح من الأيونات، تبدو القمم عريضة. إن زيادة جهد الانحياز من 4 فولت إلى 15 فولت، مما يؤدي إلى زيادة ظروف التسريع، يتسبب في تجريد بقايا الماء ومكونات المنظم، وهو ما ينتج طيفًا عالي الدقة، حيث تتوافق الكتلة المقاسة مع معقد خماسي القسيمات.

تم بعد ذلك اختيار حالة الشحنة +15 لتحليل MS الترادفي. وتسبب زيادة طاقة التصادم في إطلاق مونويمر عالي الشحنة يتمركز عند نسبة كتلة إلى شحنة قدرها 1,664 ومركب رباعي مجرد في نطاق يتراوح من 5,000 إلى 8,000 لنسبة الكتلة إلى الشحنة. كما فُحص مركب متغير الليكتين تحت ظروف مسخة مما أدى إلى ارتباط المركب.

بهذه الطريقة، يمكن تحديد الكتلة الدقيقة للوحدات الفرعية الفردية التي يتكون منها المعقد. لقد أظهرنا لك للتو كيفية الحصول على أطياف MS و tandem MS للأيونات ذات الكتلة العالية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحضير عينتك بشكل صحيح واستخدام المحاليل المنظمة المتطايرة المتوافقة فقط مع مطيافية الكتلة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.