تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الشكل العام للمعقدات البروتينية. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على بيانات مطيافية الكتلة للتنقل الأيوني لمعقدات البروتين وأيوناتها، وقياس قيم زمن الانجراف لكل حالة شحنة. وكخطوة ثانية، يتم التحقق من الظروف التجريبية لضمان قياسات التنقل للبنى البروتينية الأصلية.

بعد ذلك، يتم ربط قيم زمن الانجراف المقاسة بمساحات المقطع العرضي. وتحدد النتائج قيم المقطع العرضي للتصادم للبروتينات أو المعقدات البروتينية ذات البنى ثلاثية الأبعاد غير المعروفة. وتوفر هذه المعلومات دلالات حول شكلها العام، وتراص الوحدات الفرعية، وطوبولوجيتها.

مرحباً، أنا إسحاق ليسكي من مختبر ميك، قسم الكيمياء البيولوجية في معهد وايزمان للعلوم، ومعي نام كيرشنباوم أيضاً من مختبر ميك. سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس المقطع العرضي للتصادم للمعقدات البروتينية باستخدام مطيافية الكتلة الهجينة وأجهزة الحركية الأيونية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الشكل العام والتنظيم الفراغي للمعقدات البروتينية.

لنبدأ الآن. يركز هذا الإجراء على تحليل حركية الأيونات في الطور الغازي باستخدام مطيافية الكتلة، أو تحليل IMM MS للمعقدات البروتينية. أما خطوات تحضير العينة، ومعايرة الجهاز، وإجراءات تحسين مطيافية الكتلة ومطيافية الكتلة الترادفية، فقد تم توضيحها في بروتوكول JO ذي صلة.

بشكل عام، يتضمن هذا البروتوكول تركيزات منخفضة بمقياس الميكرومولار من المعقد في محلول منظم متطاير مثل خلات الأمونيوم. ونظراً لاستهلاك واحد إلى اثنين ميكرولتر لكل شعيرة تدفق نانوي، يجب تحضير 10 إلى 20 ميكرولتر كحد أدنى من الحجم لتمكين تحسين ظروف MS. لبدء هذا الإجراء، اضبط جهاز traveling wave أو T wave synap IMMS على أنماط التشغيل التالية: mobility tof، حيث يتم ضبط tri wave والضغوط تلقائياً لكل من IM وفصل الأيونات بزمن الطيران، واكتساب الأيونات الموجبة وV mode، مع تحديد مسار الأيونات عبر أنبوب الطيران والانعكاس، ثم قم بتشغيل جميع الغازات هنا.

يُستخدم النيتروجين لفصل IM والأرغون لمناطق المصيدة والنقل. القيم الأولية الموصى بها هي تدفق غاز بمعدل 24 milliliters per minute لجهاز IMS و 1.5 milliliters per minute لمنطقة المصيدة. بعد ذلك، قم بضبط نطاق اكتساب نسبة شحنة الكتلة لمعقد بروتيني مجهول.

استخدم نطاق كتلة واسعاً في البداية، والذي يمكن تقليصه لاحقاً إلى القيم المطلوبة، مع ضبط ملف تعريف MS وفقاً لذلك. ولتحقيق أقصى قدر من كفاءة النقل للمجمعات الكبيرة، يجب ضبط نطاق كتلة الاستحواذ من 1030 2000 نسبة الكتلة إلى الشحنة، وضبط ملف تعريف MS على الوضع التلقائي. وخلاف ذلك، يمكن ضبط ملف التعريف وفقاً للمخطط الموضح.

تحقق من إعدادات التردد الراديوي (RF)، وقم بتعديلها إذا لزم الأمر إلى القيم المناسبة لمعقدات البروتين الكبيرة كما هو موضح. بعد ذلك، قم بتحميل العينة، ثم طبق جهد الشعيرة وضغط تدفق نانوي منخفض. وبمجرد بدء عملية الرش، حاول تقليل ضغط التدفق النانوي إلى أدنى قيمة ممكنة.

بالإضافة إلى ذلك، قم بضبط موضع الشعيرة بالنسبة للمخروط، واضبط معلمات اكتساب مطياف الكتلة (MS) من أجل الحصول على طيف MS عالي الدقة. قم بتحسين تدرج الضغط على طول الجهاز ومخروط أخذ العينات، بالإضافة إلى إعدادات الجهد الكهربائي لمصيدة انحياز مخروط الاستخلاص والنقل كما هو مفصل في بروتوكول JoVE المرتبط. على الرغم من أن هذه المعلمات تعتمد على العينة، إلا أن الظروف المستخدمة لاكتساب أطياف MS لكتل حديدية متنوعة، بدءاً من الببتيدات وصولاً إلى المعقدات البروتينية، موضحة هنا.

تتطلب الأيونات الكبيرة طاقات تصادم وجهد انحياز أعلى. كما يُوصى بزيادة الضغط الخلفي عند تحليل المعقدات البروتينية الكبيرة لتقليل تنشيط المعقد إلى أدنى حد. حاول خفض جهود استخلاص مخروط العينة، ومصيدة المخروط، وجهد الانحياز تدريجياً في خطوات تبلغ حوالي 10 volts، دون تغيير موضع الذروة.

بمجرد الحصول على طيف كتلة مثالي، يجب ضبط زمن الانجراف أو ملف التنقل الأيوني (IM profile) عند تحليل التجمعات البروتينية. وغالباً ما تكون الظروف المثلى لقياسات كل من الكتلة والتنقل غير متوافقة؛ لذا، من المهم تحقيق التوازن المناسب بينهما.

بشكل عام، يجب تحسين مخطط حركية الحديد بحيث تتوزع القمم على كامل نطاق زمن الانجراف ويكون مخطط القمة سلسًا. وعندما يقترب التوزيع من كونه غيانيًا، يمكن أن يرتبط عدم التماثل الملحوظ في القمة بضعف الفصل بين التشكيلات المتعددة. ويمكن ضبط سرعة موجة T، وارتفاع موجة T، ومعدل تدفق غاز IMS لتحسين الفصل الحركي. كما يؤدي زيادة سرعة موجة T إلى توسيع مخطط توزيع زمن الانجراف.

بينما تؤدي زيادة قيم ارتفاع الموجة T إلى تضييقها، فإن زيادة تدفق غاز IMS بشكل مماثل بدءاً من حد أدنى قدره 10 milliliters per minute تزحزح ملف وقت الانجراف نحو قيم أعلى؛ لذا يجب العمل على تحسين طيف حركية الأيونات. ومن خلال تثبيت متغيرين من المتغيرات الثلاثة وتحسين المتغير الثالث، يتم ضبط سرعة الموجة T على 250 meters per second وتدفق الغاز على 24 milliliters per minute. بعد ذلك، وكـنقطة بداية، يتم ضبط الارتفاع على ثلاثة volts، ثم زيادته تدريجياً بمقدار increments قدرها volt واحد.

عند استخدام جهود انحياز عالية، يُوصى بتقليل ضغط غاز IMS وبذلك تمكين خفض جهد الانحياز. ونتيجة لذلك، سيقل تنشيط وتفكك المعقدات. قد يظهر تأثير التدحرج (rollover effect) عندما لا تكون الظروف محسنة، ويُلاحظ ذلك على شكل قمة متطابقة في الجزء الأول من طيف أزمنة الانجراف والحافة الذيلية.

عندما لا تعبر الأيونات من خلال جهاز IAM، فقد تستغرق رحلتها فعليًا وقتًا أطول من الوقت المطلوب لإطلاق حزمة الأيونات التالية في خلية الحركية. ونتيجة لذلك، يتم إطلاق مجموعة جديدة من الأيونات من منطقة المصيدة قبل وصول الحزمة السابقة إلى منطقة الدفع. وللقضاء على هذا الخلل الاصطناعي، قم بزيادة ارتفاع الموجة T وخفض سرعة الموجة T وضغط IMS.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبط وقت تحرير المصيدة. علاوة على ذلك، من المهم التحقق من ضبط ارتفاع موجة T للنقل على خمسة فولتات على الأقل. وذلك أيضاً لمنع تسرب الأيونات نحو خلية IMS.

يجب الحفاظ على ارتفاع مصيدة الحركية عند المستويات القصوى. قد تؤدي السرعة المنخفضة والسعة العالية لموجات النقل T إلى حدوث تموج في ملف توزيع زمن الانجراف. تحدث هذه الظاهرة الاصطناعية عندما لا يتم الحفاظ على الفصل الحركي للأيونات عبر مناطق النقل والمناطق الصعبة بسبب التزامن الجزئي بين تردد الدفع وسرعة موجة النقل T.

للقضاء على هذا التأثير، ينبغي ضبط إما وقت الدفع أو سرعة موجة T للنقل. وبما أن تردد الدفع مرتبط بنطاق الكتلة، فقد يظهر هذا الأثر الاصطناعي مجددًا عند تغيير هذا المعيار.

يؤثر ارتفاع موجة T بشكل طفيف، وعلى الرغم من ذلك، فإن تقليله قد يساعد أيضاً في التخلص من التموجات. وبمجرد تحسين المعلمات المذكورة أعلاه، يمكن الحصول على بيانات IMMS لتحقيق دقة تحليلية عالية.

غالبًا ما يتم تنشيط معقدات البروتين في MS.Peaks داخل مطياف الكتلة لتعزيز إزالة المياه المتبقية ومكونات المحلول المنظم. ومع ذلك، إذا زادت طاقة التنشيط عن قيمة حدية معينة، فقد يحدث تفتح جزئي يؤدي إلى تكوين حالات وسيطة متعددة، والتي من غير المرجح أن تتوافق مع بنية الحالة الأصلية في المحلول. ونتيجة لذلك، قد يزاح ذروة زمن الانجراف وتتوسع، مما يعكس التعداد غير المتجانس للبنى المتفتحة.

من أجل الحصول على بيانات زمن الانجراف المتوافقة مع بنيات الطور السائل، من الضروري التحكم بدقة في الجهود الكهربائية المستخدمة لتسريع الأيونات قبل عملية الفصل بالتنقل الأيوني (IM)، لذا يتم زيادة جهد الشعيرة وجهد المخروط تدريجيًا مع مراقبة التأثير على طيف زمن الانجراف. علاوة على ذلك، ولتحقيق دقة عالية في مطيافية الكتلة (MS)، يفضل زيادة جهد النقل بدلاً من جهد المصيدة. يتم وضع جهاز التنقل الأيوني (IM) أولاً، يليه منطقة النقل ثم محلل زمن الطيران (TOF).

بما أن التنشيط يلي قياس IM، فإن قياسات IM تظل غير متأثرة، بينما يمكن زيادة دقة MS لضمان إجراء عملية اكتساب البيانات تحت ظروف تحافظ على البنية الأصلية للمعقد، لذا من المهم جمع البيانات عبر مجموعة من الظروف التجريبية وظروف المحلول بدلاً من الالتزام بمجموعة واحدة من المعايير المُحسّنة. لهذا السبب، قم بزيادة جهد تصادم المصيدة بطريقة تدريجية واكتسب البيانات على فترات زمنية تبلغ 10 volt مع مراقبة التأثير على ملف حركية الحديد. وأخيراً، لتحديد التشكيلات غير المطوية وتقييم البيانات المكتسبة، قم بتحفيز تفكك معقد البروتين يدوياً عن طريق معايرة العينة بحمض الأسيتيك عبر نطاق pH من اثنين إلى سبعة وسجل البيانات، ثم انتقل لتحليل البيانات في نظام T wave IMS، حيث يتم تحديد المساحات المقطعية باستخدام نهج معايرة وقت الانجراف، وذلك باستخدام بروتينات Cain ذات قيم مساحة مقطعية معروفة.

أولاً، قم بتحضير محاليل بروتينات المعايرة الممسوخة بتركيز 10 micromolar لكل منها. استخدم equine cytochrome C horse و heart myoglobin و bovine ubiquitin في مزيج من الماء والميثانول وحمض الأسيتيك بنسبة حجمية 49:49:0.2. بعد ذلك، احصل على بيانات IMMS لبروتينات المعايرة تحت نفس ظروف الجهاز المستخدمة تماماً للبروتين المستهدف أو المعقد البروتيني، مع الحفاظ على جميع قيم الجهد والضغط متطابقة للحفاظ على إعدادات فصل الـ IM.

بعد الحصول على البيانات، استخرج قيمة زمن الانجراف التجريبي لكل شحنة. لتصحيح أزمنة انجراف المعايرة T prime D، استخدم المعادلة التالية حيث تمثل MOVZ نسبة الشحنة الرئيسية للأيون المرصود، و C هو معامل تأخير دورة العمل المحسنة EDC. وتتراوح قيمته عادةً بين 1.4 و 1.6 وتعتمد على الجهاز المستخدم.

تظهر قيمة EDC ضمن إعدادات الحصول على البيانات في النظام (system one acquisition settings)، في علامة تبويب إعداد الحصول على البيانات (one acquisition setup tab)، حيث يتم تصحيح كل مقطع عرضي للمعايرة لكل من حالة شحنة الحديد والكتلة المختزلة. حيث تمثل omega C المقطع العرضي المصحح، وomega المقطع العرضي المذكور في المراجع العلمية، وZ حالة شحنة الحديد، وM الوزن الجزيئي لأيون السلسلة، وMG الوزن الجزيئي للحديد.

غاز الخلفية، والذي يكون عادةً النيتروجين، يتم رسم العلاقة بين T prime D مقابل omega C. يتوافق المنحنى الناتج مع المعادلة التالية. يمكن استخراج المعاملين X و A من خلال مواءمة الرسم البياني مع علاقة خطية. يمثل الميل X عامل التناسب الأسي، بينما يمثل A الثابت المحدد من عملية المواءمة.

احسب معامل ارتباط الملاءمة R squared. القيم المقبولة لـ R squared هي التي تزيد عن 0.95. قد تعود قيمة معامل الارتباط المنخفضة إلى عدم اكتمال تفكك البروتين، أو تقادم العينة.

ظروف تجريبية غير متماثلة مستخدمة للبروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة، أو طيف مشوش، أو معالجة غير كاملة للبيانات، أو خطأ في الحساب. قم بتصحيح زمن الانجراف ca باستخدام العامل الأسي X المحدد، وتحقق من صحة حساباتك عن طريق إعادة رسم omega C مقابل T prime D. حدد مرة أخرى معامل الارتباط؛ ومن المتوقع أن تكون القيم أعلى من 0.95. وبشكل مشابه للخطوات الموضحة سابقاً، قم بتصحيح زمن الانجراف المقاس للبروتين المستهدف أو المعقد البروتيني، وقم بمعايرة زمن الانجراف للبروتين المستهدف أو المعقد البروتيني باستخدام العامل الأسي X المحسوب. احسب omega للبروتين المستهدف أو المعقد البروتيني باستخدام الثابت A المحدد من عملية الملاءمة، حيث omega تساوي a TD. كرر هذه الخطوات لكل ظرف تجريبي.

عند تحديد مساحة المقطع العرضي للبروتين المجهول أو المعقد البروتيني، نوصي بتكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل، وحساب الانحراف المعياري لهذه القياسات الثلاثية بمجرد تحديد قيم مقطع التصادم العرضي. تُستخدم مناهج النمذجة للتنبؤ بالتوبولوجيا أو الترتيبات الخاصة بالمعقد؛ ويتم ذلك من خلال مطابقة قيم مقطع التصادم العرضي التجريبية مع قيم Omega المحسوبة حاسوبياً (in silico) من هياكل النماذج التي تم إنشاؤها. وبشكل عام، لا يزال هذا المجال في سنواته الأولى، ويتطلب مزيداً من التطوير لجعل هذا النهج عاماً وقابلاً للتطبيق على نطاق واسع من المعقدات.

يظهر هنا التمثيل السطحي للشكل الرباعي للهيموغلوبين البقري. يمكن أن يعمل معقد الهيموغلوبين الناقل للأكسجين كمثال على المنهج المذكور أعلاه. الهيموغلوبين هو معقد بروتيني رباعي يتكون من وحدتين فرعيتين من ألفا ووحدتين من بيتا، ملونتين بالأزرق والأحمر على التوالي، واللتين تشكلان ثنائياً من ثنائيات ألفا وبيتا.

يظهر هنا طيف IMMS للهيموجلوبين. ويكشف طيف IM ms المكتسب للمركب عن توزيع سلسلة شحنات رئيسية تتوافق مع المركب السليم، وسلاسل شحنات ثانوية تتوافق كتلها مع ثنائي الوحدات alpha beta والوحدات الفرعية الأحادية alpha وbeta. كما يظهر هنا مقطع العرض التصادمي (CCS) النظري والمقاس للأشكال المختلفة للهيموجلوبين.

استُخدمت قيم زمن الانجراف المسترجعة لعدة حالات شحن للأشكال الثنائية والرباعية لحساب قيم أوميغا. وقورنت هذه القيم بالقيم النظرية. وبالنظر إلى أن المعقد الرباعي لديه ثلاثة احتمالات للارتباط، إما أن تكون تعبئة حلقية ثنائية السطح أو على شكل سلسلة.

يمكن التنبؤ بالتنظيم البنيوي من خلال حساب الزيادة في omega عند الانتقال من ديمر (dimer) إلى تترامير (tetramer). وقد أظهرت الدراسات السابقة وتجاربنا وجود ارتباط قوي بين ccss المقاسة ومساحات سطح البروتين المشتقة من بيانات البنية البلورية. ويمكن استخدام هذا الارتباط لحساب الزيادة المتوقعة في مساحة سطح التترامير مقارنة بالديمر لأشكال التعبئة المختلفة.

يتم ذلك من خلال اعتبار كل وحدة فرعية كجسم غير كروي. ومن شأن التجميع الذي يتخذ شكل سلسلة أن يزيد من مساحة المقطع العرضي للتصادم (CCS) للرباعي بمقدار الضعف تقريبًا، بينما يؤدي التعبئة من نوع C4 أو D2 إلى زيادة قدرها 1.5 و1.67 على التوالي. وكانت النسبة المحسوبة بين قيم CCS المقاسة للهيموجلوبين في شكليه الرباعي وDME هي 1.57 ± 0.03.

يوضح هذا الرقم أن البنية الأصلية ليست منظمة خطياً، بل مرتبة في شكل أكثر تراصاً، إما كرباعي قسيم حلقي أو ثنائي السطح. وعند تكرار الحساب نفسه على البنية البلورية المحلولة للهيموجلوبين، كانت نسبة مساحات السطح للأشكال رباعية القسيم مقارنة بأشكال DME هي 1.63، وهو ما يتوافق مع تماثل D two. ومن الواضح أن هذا النموذج الهندسي كان مبسطاً، وأن الوحدات الفرعية للبروتين ليست مجرد كرات.

ومع ذلك، توضح هذه الحسابات الإمكانات الواعدة التي توفرها تقنية IMMS في الكشف عن كيفية تعبئة المعقدات ذات البنى عالية الدقة غير المعروفة. لقد أوضحت لكم للتو كيفية قياس زمن الانجراف للبروتين والمعقدات البروتينية، وكيفية حساب قيم المقطع العرضي للتصادم الخاصة بها. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من الضروري الحصول على بيانات IMMS للبروتينات القياسية باستخدام نفس الظروف الدقيقة المستخدمة للبروتين المستهدف أو المعقدات البروتينية.

علاوة على ذلك، نوصي بشدة بتكرار هذه التجارب ثلاث مرات على الأقل وتحديد الانحراف المعياري لهذه القياسات الثلاثية. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.