ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

يختبر هذا الإجراء التفاعل البروتيني-البروتيني في الجسم الحي بين منظمين للنسخ في نبات Arabidopsis، وهما SEU و LUH. ومن خلال استخدام تقنية التكامل الفلوري للجزيئات الحيوية، يتم دمج SEU مع القطعة الطرفية النهائية لبروتين فلوري أصفر (YFP)، بينما يتم دمج LUH مع القطعة الطرفية C لـ YFP-DNA في كلا البناءين البلازميديين. يتم قذف SEU-NYFP و LUH-CYFP داخل خلايا البشرة في البصل لاختبار التفاعل بينهما.

يؤدي التفاعل بين Seuss و LUH إلى ارتباط الشظايا الطرفية النهائية والطرفية C لبروتين YFP في النوى، مما ينتج عنه ظهور تألق YFP في النوى. بعد التحضين لمدة تتراوح من 16 إلى 20 ساعة في الظلام، يتم فحص قشور بشرة البصل تحت مجهر فلوري لتصور التألق. مرحباً، أنا كورتني هولاندر من مختبر الدكتور Zhi Lu في قسم بيولوجيا الخلية والوراثة الجزيئية بجامعة ميريلاند.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لاختبار التفاعل بين البروتينات في خلايا البصل باستخدام مسدس الجينات BioRad Helios. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لاختبار التفاعلات بين البروتينات وتحديد التموضع البروتيني في الخلايا النباتية. لذا، فلنبدأ.

لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز الخراطيش الخاصة بمسدس الجينات Helios باتباع بروتوكول Joe Video الذي وضعه Woods و Zeto عام 2008، والذي يوضح بالتفصيل إجراء تحضير الخراطيش لكل عملية تجهيز. يتم خلط 50 micrograms من DNA البلازمي الكلي مع 12.5 milligrams من جزيئات الذهب و 0.5 milligrams per milliliter من محلول PVP لتقنية BIFC. وبدمج نفس طريقة تحضير الخراطيش، يتم استخدام نوعين من DNA البلازمي للبروتينات التي يُفترض أنها متفاعلة: Seuss المدمج مع النصف الطرفي N لبروتين YFP، والذي يُرمز له بـ seus، NYFP، و LU Homolog المدمج مع النصف الطرفي C لبروتين YFP والذي يُرمز له بـ L-U-H-C-Y-F-P.

تبلغ الكمية الإجمالية 50 ميكروجرام لكل تحضيرة، مما ينتج ما يصل إلى 50 خرطوشة بمعدل ميكروجرام واحد من DNA لكل 0.25 مليجرام من الذهب في كل خرطوشة. تُستخدم كل خرطوشة لمرة واحدة. بعد تحضير الخراطيش، اختبرها للتأكد من دفع جزيئات الذهب بكفاءة.

لُف قطعة مربعة من البارافورم حول طبق بتري. بعد ذلك، اضبط ضغط الهيليوم ليكون بين 150 و200 PSI وأطلق الخراطيش التي تم تصنيعها حديثًا في مربع البارافورم. لاحظ وجود جزيئات ذهبية باهتة على البارافورم.

يمكن دفع كميات مختلفة من جزيئات الذهب على العينة عند ضغوط مختلفة من الهيليوم. ومع ذلك، في حال عدم وجود فرق جوهري، يتم اختيار الضغط الأقل لعملية القصف. كما يشير هذا الاختبار إلى المساحة التي تغطيها كل عملية قذف.

لتحضير أنسجة البصل، قم بإزالة القشرة الخارجية من بصلة صفراء كبيرة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وحادة. اقطع منطقة مستطيلة بمقاس 2 × 8 سنتيمتر، بعمق يتراوح من أربع إلى خمس طبقات. استخرج نسيج البصل المستطيل وتخلص من الطبقتين الخارجيتين.

قطّع الطبقات المتبقية من البصلة إلى قطع مربعة يبلغ حجمها حوالي 1.5 سنتيمتر. ضع قطع البصل في طبق بتري يحتوي على دوائر من ورق ترشيح بقطر 3 مم. قم بترطيبها بالماء المعقم ثم غطِّ طبق بتري.

قطع البصل جاهزة للقصف. أولاً، قم بتحميل الخراطيش في حوامل الخراطيش البيضاء المستديرة، مع تحميل الخراطيش التي تحتوي على تركيبات بلازميدية مختلفة في حوامل خراطيش مختلفة. يمكن لكل حامل خراطيش استيعاب ما يصل إلى 12 خرطوشة لـ 12 ضربة.

يتم هنا تحميل ثلاثة حاملات مختلفة. يحتوي الحامل الأول على خراطيش تحتوي على 35 S-G-F-P-A، وهو محفز قوي وتأسيسي من فيروس موزاييك القرنبيط. يعمل هذا البلازميد كضابط موجب.

يتم تحميل الحامل الثاني بالخراطيش التجريبية التي تحتوي على كميات متساوية من S-E-U-N-Y-F-P و L-U-H-C-Y-F-P. ويتم تحميل حامل الخراطيش الثالث بخراطيش تحتوي على خليط مولاري متساوٍ من ناقل puck spine و LUH puck spice، وهو ما يعمل أيضاً كضابط سلبي.

أدخل البطارية وبطانة السبطانة الجديدة في مسدس الجينات Helios. تأكد من تركيب الحلقات المانعة للتسرب (O-rings) الخاصة بكل من بطانة السبطانة والمسدس. بعد ذلك، أدخل حامل خرطوشة فارغاً في مسدس الجينات بحيث يكون الرقم 12 الموجود على حامل الخرطوشة مواجهاً للجزء العلوي من المسدس.

قم بدفع حامل الخرطوشة مرة أو مرتين للتأكد من إدخاله بشكل صحيح. بعد ذلك، قم بتوصيل المسدس بخزان الهيليوم واضبط الضغط ليكون بين 150 و200 PSI. أرتدي واقيات الأذن وأقوم بإطلاق المسدس عدة مرات عن طريق الضغط المستمر على الزر الجانبي أثناء سحب الزناد. إن إطلاق المسدس مع وجود حامل خرطوشة فارغ يعمل على تنظيف غرفة المسدس وضمان استقرار الضغط.

قبل إطلاق الـ DNA، يمكن إطلاق قطعة من البصل هنا لتكون بمثابة ضابط سلبي للفلورة الخلفية. لإطلاق الجسيمات الذهبية المغلفة بالـ DNA، قم بإزالة حامل الخرطوشة الفارغ وأدخل حامل الخرطوشة الأول المحمل الذي يحتوي على الضابط الإيجابي. قم بتحريك حامل الخرطوشة بحيث تكون الخرطوشة المخصصة للإطلاق في الجزء السفلي من حامل الخرطوشة.

ضع الآن قطع البصل في منتصف طبق بتري فارغ بحيث تكون الطبقة الداخلية للبصل متجهة للأعلى. ضع بطانة سبطانة مسدس الجينات على طبق بتري وأطلق النار من المسدس. انتقل إلى الخرطوشة التالية وأطلق النار على قطعة بصل أخرى.

كرر هذه الخطوة حتى يتم قذف أربع إلى خمس قطع من البصل. يتم قذف كل قطعة بصل مرة واحدة فقط. انقل قطعة البصل المقذوفة إلى أطباق بتري تحتوي على ورق ترشيح مبلل بقياس 3 mm لإطلاق الخراطيش التجريبية.

قم بتغيير خرطوشة Holden. ثانياً، تذكر تغيير بطانة الاسطوانة لمنع التلوث. قم بتصوير أربع إلى خمس قطع من البصل كما هو موضح للتو من أجل الضابط الموجب.

ثم انتقل إلى خرطوشة Holden رقم ثلاثة، والتي تحتوي على DNA الخاص بالضابط السلبي. ومرة أخرى، قم بحقن من أربع إلى خمس قطع من البصل.

قم بتغيير بطانة الأسطوانة لمنع التلوث. بعد القصف، قم بتغطية أطباق بيتري التي تحتوي على قطع البصل بالأغطية.

غلّفها بـ paraform لمنع الجفاف. حضّن قطع البصل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة تتراوح من 16 إلى 48 ساعة. بمجرد الانتهاء من القصف، أغلق الغاز وحرر الضغط قبل فصل مدفع الجينات عن خزان الهيليوم، ثم قم بفك بطانة السبطانة وإزالة حامل الخراطيش والخراطيش المستخدمة.

أخيرًا، قم بتنظيف حوامل الخراطيش وبطانات الأسطوانة عن طريق غمرها في بيكر يحتوي على ماء وصابون، ثم استخدم جهاز سونيكيت لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، اشطفها بالماء لإزالة جميع بقايا الصابون.

انقع القطع في ethanol بتركيز 70% لمدة ساعة واحدة ثم جففها باستخدام مناشف ورقية. باشر بفحص قطع البصل بعد مرور 16 إلى 20 ساعة من عملية القصف. بعد تحضين قطع البصل المقصوفة لمدة 16 إلى 20 ساعة في درجة حرارة الغرفة، استخدم ملقطاً ذا نهايات مسطحة لتقشير طبقة خلوية واحدة ببطء من البشرة الداخلية للبصل.

هذه هي الطبقة التي تواجه القذيفة مباشرة أثناء القصف. ضع الطبقة المقشرة فوق قطرة من الماء على شريحة زجاجية مع غطاء الشريحة، مع الحرص على تقليل الفقاعات إلى أدنى حد.

راقب فلورة GFP أو YFP باستخدام مجهر فلوري مثل zes axio observer, point Z one الموضح هنا تحت الحقل المضيء للمجهر. تحقق أولاً من التدفق السيتوبلازمي للتأكد من أن الخلايا حية. وللقيام بذلك.

عرض الشريحة لضوء المجال المضيء لبضع دقائق لتدفئة أنسجة البصل، ثم ابحث عن حركة البلازميد؛ إذ لا يكون التدفق السيتوبلازمي مرئياً دائماً، لذا لا تشعر بالإحباط إذا لم يكن واضحاً. للكشف عن الفلورة، استخدم مرشحات الإثارة والكشف المناسبة لـ GFP أو YFP. تحقق أيضاً من الضوابط السلبية، وهي قطع البصل التي تم حقنها ببلازميد غير فلوري.

قد تظهر إشارات صفراء باهتة من الخلايا المتضررة والحطام وبصلات البصل. كما يجب التحقق من الضوابط الموجبة، وهي البلازميد الذي يحتوي على مراسل فلوري يتم التعبير عنه بشكل مستمر.

يظهر فلورة GFP في بعض الخلايا وليس جميعها. كما قد تنتج فقاعات الهواء فلورة خلفية. تشير إشارات GFP المرئية من خلايا بشرة البصل إلى أن الخراطيش وأنسجة البصل وعملية إطلاق مسدس الجينات قد تم تحضيرها وتنفيذها بشكل صحيح.

يظهر هنا الفلورة القوية الملحوظة من البلازميد الموجب لـ 35 SGFP. وتظهر الفلورة القوية في الخلية بأكملها، بما في ذلك النواة والسيتوبلازم. وتسمح صورة المجال المضيء برؤية المخطط التفصيلي المقابل للخلايا والنوى.

ليست كل خلية متحولة. يتم الكشف عن إشارة الفلورة YFP في نواة خلية البصل عند قذف المزيج التجريبي Seuss وNYFP وL-U-H-C-Y-F-P داخل خلايا البصل، مما يشير إلى أن Seuss NYFP وL-U-H-C-Y-F-P يتفاعلان في vivo. ومع ذلك، فإن الفلورة الناتجة عن هذا التفاعل أضعف بكثير من الفلورة الناتجة عن 35 SGFP في الضابط الموجب.

بالإضافة إلى ذلك، يتركز عاملا النسخ SEUS وLUH في النوى. وبالتالي، لا يُلاحظ تألق YFP إلا في النواة. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الخلايا المتألقة أقل بكثير من عدد خلايا الضابط الموجب 35 SGFP.

يعود ذلك إلى أن تقنية B FFC لا تعمل إلا عندما يتم التعبير عن كلا البلازميدين الشريكين في نفس خلايا البصل. لا يتم اكتشاف أي إشارة فلورية في البصل الذي تم قصفه بحامل الخراطيش رقم ثلاثة الذي يحتوي على مزيج من puck spine وvector وL-U-H-C-Y-F-P، وهو الأمر المتوقع بالنسبة للمجموعة الضابطة السلبية. لقد شرحنا لكم للتو كيفية قصف خلايا البصل لاختبار التفاعلات بين البروتينات باستخدام نظام مسدس الجينات BioRad Helios.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام ضوابط إيجابية وسلبية مناسبة، ومعرفة أن فلورة BIFC قد تكون أضعف في الإشارة وأقل في عدد الخلايا الفلورية. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.