الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

تهدف هذه التجربة إلى تحديد ما إذا كان هناك تفاعل بين بروتينين داخل الخلايا، وتوضيح جوانب مواقع هذا التفاعل. أولاً، يتم نقل بنيات تعبيرية إلى الخلايا تشفر البروتينين المعنيين، بحيث يتم دمج أحدهما في الطرف النهائي لبروتين فلوري مجزأ، والآخر في الطرف C المكمل للبروتين الفلوري المجزأ. وبعد السماح للخلايا المنقولة بتطوير إشارة فلورية في المزرعة، يتم تصور المعقدات البروتينية عن طريق التصوير واللطخة المناعية.

بعد ذلك، يتم تصدير الصور التي تم جمعها إلى برنامج تحليل صور مثل Image J من أجل قياس متوسط شدة الفلورة لكل خلية. في تجربة مضبوطة، يمكن لنتائج BIFC أن توضح التفاعلات بين البروتينات ومواقع تموضع هذه المعقدات، مثل تقاطع نطاقات SH three للبروتين السقالي ونطاق pro rich لبروتين PI three KC two beta. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التوضع المشترك (colocalization)، والترسيب المناعي (immunoprecipitation)، و FRET، في أن BFC تسمح بتحديد الموقع المكاني للتفاعلات العابرة الأضعف داخل الخلية. كما أن هذه الطريقة لا تتطلب معالجة مكثفة للصور بعد الالتقاط كما هو متبع في FRET.

يمكن لهذه الطريقة معالجة أسئلة رئيسية في مجال نقل الإشارة، مثل ما إذا كانت البروتينات X و Y تتفاعل، وإذا كان الأمر كذلك، فما هي المقصورات المحددة التي تتمركز فيها هذه المعقدات داخل الخلية؟ وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في استخدام هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم لم يختاروا التكوين المناسب للتعبير عن خزعتهم. البروتينات الملحقة ذات الأهمية: ابدأ باختيار أحد الفلوروفورات المتعددة لبروتينات الاندماج BIFC.

ضع في اعتبارك أن النهايات الطرفية الأمينية والكربوكسيلية لبروتين Venus قادرة على تشكيل معقد عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، بينما تتطلب شظايا Y-F-P-B-I-F-C تحضينًا مسبقًا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. صمم ناقلات تعبير لإضافة الوسوم إلى البروتينات المستهدفة من خلال دراسة مدى تأثير ربط شظايا BIFC على وظيفة البروتينات المستهدفة. على سبيل المثال، تخضع عائلة RAs، وبروتينات GTP a's لتعديل ليبيدي عند الطرف الكربوكسيلي، ولا يمكن وسمها عند هذه النهاية دون تعطيل هذا التعديل.

قم دائمًا بإجراء تجارب استطلاعية لتحديد ظروف عفن transfection. كما يجب مراقبة الخلايا بواسطة المجهر الفلوري لتحديد الوقت الأمثل لظهور الإشارة. بعد ذلك، قم بإجراء تحليل western blossom للتأكد من التعبير المتساوي للنواتج الجينية (constructs).

من المهم إجراء صبغ مناعي لوسم HA أو flag للتحقق من أن إضافة قطع BIFC لا تغير التموضع الخلوي للبروتينات المستهدفة في كل لوحة عينات. قم بتوزيع 1.3 × 10 من الخلايا الخمس في كل لوحة زجاجية القاع وبئرَيْن من لوحة ذات ستة آبار، واترك الخلايا تستقر طوال الليل في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C. في اليوم التالي، قم بتحضير حمض DNA لعملية عفن الخلية (transfection) باستخدام lipofection أو أي طريقة أخرى مفضلة.

أولاً، قم بتخفيف الـ DNA في 250 µL من وسط DMEM الخالي من المصل ليكون بمثابة ضابط لعملية عفن الخلية (transfection control). أضف CFP بنسبة 1:50، وهي كمية إجمالي الـ BIFC DNAs المستخدمة. الآن قم بتخفيف الـ lip في 250 µL من وسط DMEM الخالي من المصل باستخدام 10 µL من الـ lip لكل 1 µg من الـ DNA.

امزج مخففات DNA والليبوسومات ثم حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام وسط DMEM الدافئ الخالي من المصل. أضف 2 milliliters من وسط DMEM الخالي من المصل إلى كل طبق ذو قاعدة زجاجية أو بئر في طبق سداسي الآبار.

بعد ذلك، وزع كل خليط ترانسفكشن بالتساوي بين طبق واحد ذو قاعدة زجاجية وبئرَيْن من طبق سداسي الآبار، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. وأخيراً، أزل وسط الترانسفكشن واستبدله بوسط DMEM كامل مضاف إليه 10% FBS.

قم بتحضين الخلايا للمدة التي تم تحديدها في التجارب الاسترشادية للحصول على مستويات التعبير اللازمة للبروتينات المستهدفة. افحص الخلايا المنقولة جينياً باستخدام مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescent microscope) للتأكد من أن الضابط الموجب يظهر الفلورة. اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS من أجل تصوير الخلايا الحية.

ضع الخلايا في وسط غذائي يخلو من صبغات المؤشر. ولتصوير الخلايا المثبتة، أضف 2% paraformaldehyde وضعها على الثلج لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم غطِّها بـ 1 mL من PBS واحفظها في الظلام عند درجة حرارة 4 °C، ثم قم بتحليل الخلايا في طبق الست فتحات فوراً. بالنسبة لتحليلات Western blot، من المهم تحضير جميع الخلايا في الوقت ذاته لضمان أن تكون الخلايا المحللة ممثلة للخلايا التي تم تصويرها. قم بإجراء Western blot للتأكد من تعبير البروتينات الموسومة بمستويات متكافئة.

عند تصوير الخلايا باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، من المهم الحفاظ على ثبات الإعدادات طوال التجربة لضمان إمكانية مقارنة التألق بين العينات. تأكد من تصوير خلايا فردية بحيث لا تكون البكسلات مشبعة. وبما أن CFP قد أُدرج كعنصر تحكم في عملية عفن الخلايا (transfection control)، فاختر الخلايا الموجبة لـ CFP فقط لتحليل إشارات BIFC.

قم بقياس الفلورة كمياً باستخدام برنامج تصوير مثل Image J. افتح ملفات الصور في برنامج Image J. انتقل إلى analyze ثم set measurements. حدد المربعات الخاصة بـ area و mean gray value في صندوق القياسات. لاحظ أنه في هذا المثال، تم تلوين الصور الوريدية باللون الأخضر الكاذب وصور CFP باللون الأحمر الكاذب.

باستخدام أداة التحديد الحر، ارسم مخططاً حول حافة الخلية بأكملها في قناة CFP مع ترك هذا المخطط في مكانه. انتقل إلى قناة YFP. اذهب إلى قائمة "تحليل" (analyze)، وقم بقياس قيمة الرمادي المتوسطة التي تعكس متوسط شدة الفلورة لكل خلية في كل صورة.

ارسم دائرة في قناة YFP في منطقة لا تحتوي على خلية. قم بأخذ قياس لهذه المنطقة كخلفية. اطرح قيمة الخلفية من كل صورة.

وأخيرًا، لحساب متوسط شدة الفلورة لمجموعة من الخلايا، يتم حساب متوسط قيمة الدرجة المتوسطة مطروحًا منها الخلفية لجميع الخلايا التي تم تصويرها في عينة واحدة. ومن المثالي قياس 60 خلية عبر ثلاث تجارب. ينظم بروتين السقالة متعدد النطاقات intersecting بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم فئة جديدة من PI three kinase class two، حيث تتفاعل نطاقات SH3 لبروتين PI3KC2β intersecting مع المنطقة الغنية بالبرولين في الطرف الأميني لبروتين PI3KC2β. ويؤدي ترصيص intersecting المسمى بـ VN مع PI3KC2β المسمى بـ VC إلى ظهور إشارة فلورية في قناة YFP، والتي يتم تلوينها اصطناعيًا باللون الأخضر للإشارة إلى تكوين المعقد.

يُستخدم CFP الملون هنا باللون الأحمر كعنصر تحكم لتمييز الخلايا المنقولة؛ حيث تؤدي الطفرات في النطاق الغني بالبرولين لبروتين PI three KC two beta إلى تعطيل الترسيب المشترك لـ intersecting و PI three KC two beta، مما يقلل من إشارة BIFC. لا يعود هذا الاختلاف في إشارة BIFC إلى اختلافات في التعبير عن بروتينات PI three K من النوع البري و PA. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، يجب تذكر تشغيل عناصر التحكم المناسبة والتحقق من التعبير البروتيني لضمان أن الاختلافات في إشارة BC تعود إلى الاختلافات في تكوين المعقد وليس بسبب التعبير البروتيني المتبع في هذا الإجراء.

يمكن إجراء تقنيات أخرى، مثل رنين البلازمون السطحي على المقيمين، للإجابة على أسئلة مثل: ما هي الألفات المختلفة لهذه المعقدات تجاه بعضها البعض؟