Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام البروتينات الفلورية M orange two andron للإبراز البصري بالمجس المزدوج لوسم أربعة مجتمعات خلوية فردية أو مقصورات خلوية بشكل انتقائي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضاءة الخلايا بضوء استثارة منخفض الكثافة بطول موجي 488 nanometer لإيقاف جميع الفلورية الخضراء. وفي خطوة ثانية، يتم تعريض الخلايا لضوء استثارة عالي الكثافة بطول موجي 488 nanometer، مما يحول الفلورية الخاصة بـ m orange ضوئياً إلى اللون الأحمر.

بعد ذلك، تُعرض الخلايا لإثارة فوتونين بطول موجي 800 nanometer من أجل تفعيل الفلورة المزدوجة. ومرة أخرى، تم الحصول على نتائج تُظهر إمكانية وسم الخلايا في أربعة تركيبات متميزة بناءً على التمييز البصري باستخدام المسبارين M Orange two و drawn ppa. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بالتجارب الحالية مثل التجزئة تحت الخلوية في أنه يتم إجراؤه على خلايا حية.

يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا خلايا بيتا، مثل سبب إفراز جزء صغير فقط من حويصلات الإنسولين. وعلى الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أن يوفر رؤى حول وظيفة خلايا بيتا، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على أنظمة أخرى، مثل تتبع الخلايا السرطانية في الجسم الحي. تتكون عينة قطيرة البروتين الفلوري من مستحلب مائي ثماني الأوجه يوجد فيه بروتين فلوري في الطور المائي.

يتم وضع هذا المستحلب بين شريحة مجهرية وغطاء زجاجي مربع بحجم 22 مليمتر لتطبيقات الفحص المجهري. في بداية هذا الإجراء، يجب تنظيف الشرائح المجهرية والأغطية الزجاجية وطلاؤها بعامل كاره للماء. نظف الأدوات الزجاجية بغسلها باستخدام الأسيتون لمدة خمس دقائق.

بعد الغسيل، اترك الأدوات الزجاجية لتجف في الهواء. بعد ذلك، قم بتحضير محلول methyl trimethoxy seline بتركيز 2% في الأسيتون، واغمر الأدوات الزجاجية في المحلول لمدة دقيقتين. بعد عملية الطلاء، أخرج الأدوات الزجاجية من المحلول واتركها لتجف.

بعد ذلك، اشطف الأدوات الزجاجية باستخدام ethanol بتركيز 70% من زجاجة رذاذ. وبعد الشطف، اترك الأدوات الزجاجية لتجف في الهواء مرة أخرى وقم بإزالة أي سائل متبقٍ. وباستخدام الهواء المضغوط، يمكن تخزين الأدوات الزجاجية المطلية لمدة شهر واحد على الأقل.

بمجرد تجهيز الأدوات الزجاجية، يتم الحصول على البروتينات الفلورية التي سبق تنقيتها كبروتينات ذات وسم his من بكتيريا e coli. قم بقياس طيف الامتصاص للبروتين المنقى. ثم حضّر تخفيفاً مخزونياً بكثافة ضوئية تبلغ 0.1 تقريباً في محلول tris buffered saline بـ pH ثمانية يحتوي على 0.1% bovine serum albumin.

بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير 10 milliliters من خليط بنسبة واحد إلى واحد من octanol ومحلول tris buffered saline في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وامزجه بقوة. بعد المزج، اترك الخليط حتى يكتمل انفصال الطورين. الطور العلوي هو octanol؛ ولتحضير المستحلب، قم بسحب 45 µL من octanol و 5 µL من البروتين الفلوري بواسطة الماصة في أنبوب epi orph.

انقر على الأنبوب عدة مرات لبدء تكوين المستحلب، ثم قم بمعالجة الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 ثانية في حمام سونيكاتور. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز شريحة مجهر مطلية وغطاء شريحة لاستخدامهما بعد عملية السونيكاتور. يجب أن يكون المستحلب عكراً تماماً.

اسحب فوراً أربعة µL من المستحلب من منتصف الأنبوب باستخدام الماصة وضعها على شريحة مجهرية مطلية، ثم غطِّها بغطاء شريحة مطلي. يجب أن ينتشر المستحلب بالتساوي بين الشريحة المجهرية وغطاء الشريحة. ومن المفترض أن تصبح العينة مستقرة في غضون دقائق.

يُعد الإجراء التالي استراتيجية عامة لإعداد تجربة تحويل ضوئي للبروتين الفلوري باستخدام مجهر المسح الليزري متحد البؤرة. ويمكن تطبيق هذا الإجراء على البروتينات المنقاة وكذلك على الخلايا الحية. وفي هذه التجربة، تُستخدم عينة من قطيرة تحتوي على بروتين m orange two منقى كنقطة بداية عامة لتجربة التحويل الضوئي.

قم بإعداد المجهر البؤري الماسح بالليزر (confocal laser scanning microscope) على النحو التالي. استخدم عدسة شيئية غمر زيتي بفتحة عددية 40 x 1.3، وحجم صورة يبلغ 512 في 512 بكسل. اضبط زمن بقاء البكسل على ستة ميكروثانية لكل مسح، ومستوى التكبير (zoom) على أربعة، وقم بزيادة حجم الثقب (pinhole) ليتناسب مع دقة Z تبلغ ثلاثة ميكرونات.

قم بتكوين قناتي كشف للفلورة الأولية والمحولة ضوئياً، بالإضافة إلى قناة للتحويل الضوئي. راقب الأنواع البرتقالية باستخدام ضوء إثارة بطول موجي 561 nanometer واجمع الفلورة بين 570 و 630 nanometers. اكشف عن الأنواع الحمراء المحولة ضوئياً باستخدام ضوء إثارة بطول موجي 633 nanometer واجمع الفلورة بين 640 و 700 nanometers.

بالنسبة لقناة التحويل الضوئي، اختر خط الليزر بطول موجي 488 نانومتر واجمع الفلورة بين 490 و 540 نانومتر. التصوير. لا تعتبر قناة التحويل الضوئي ضرورية بشكل صارم ولكنها قد تكون مفيدة. لبدء التجربة، استخدم قناة الكاشف لتصوير الفلورة الأولية مع المسح المستمر لضبط قدرة الليزر وكسب الكاشف من أجل الحصول على جودة صورة مثالية.

بعد ذلك، قم بتنشيط قناة التحويل الضوئي واختر طاقة ليزر منخفضة. ابدأ في تصوير سلسلة زمنية (time-lapse) وزد تدريجياً من قوة ليزر التحويل الضوئي حتى يُلاحظ تلاشٍ ملحوظ للوميض الأولي. استمر في المسح حتى يتلاشى الوميض الأولي بنسبة 75% تقريباً.

بعد ذلك، قم بإلغاء تنشيط قناة التحويل الضوئي وتنشيط قناة الكشف عن الفلورة المحولة ضوئياً. ابدأ التصوير باستخدام كسب عالٍ للكاشف مع قدرة ليزر منخفضة. ثم قم بزيادة قدرة الليزر تدريجياً حتى يتم الكشف عن الفلورة المحولة ضوئياً.

بمجرد الكشف، اضبط قدرة الليزر والكشف أو الكسب (gain) للحصول على جودة صورة مثالية. وأخيراً، قم بتحسين قدرة الليزر المستخدمة للتحويل الضوئي وكذلك مدتها. ومن شأن زيادة قدرة الليزر أن تسرع معدل التحويل الضوئي.

ومع ذلك، فإن زيادة قدرة الليزر بشكل مفرط ستؤدي إلى تبييض البروتين ضوئياً. وبمجرد تحديد التحويل الضوئي والقدرة والمدة المثلى لليزر، يمكن استخدام هذه المعلمات لتكوين وحدة تبييض ضوئي قياسية أو وحدة استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي. وعندئذٍ، لن تكون قناة التحويل الضوئي مطلوبة بفضل خصائص الإزاحة الحمراء الطيفية لـ M orange two.

يمكن استخدامه بالاقتران مع البروتين الفلوري القابل للتبديل ضوئياً باللون الأخضر drawn PU من أجل التمييز البصري بالمسبار المزدوج. لبدء التمييز البصري بالمسبار المزدوج، قم بزراعة خلايا hela في أطباق ذات قاعدة زجاجية، ثم قم بنقل البلازميدات التي تشفر البروتينات الفلورية إلى الخلايا قبل 24 ساعة من التصوير باستخدام طريقة LIPECTOMY 2000 القياسية للنقل.

ضع الخلايا الحية على مجهر مسح ليزري بؤري وقم بإعداد المجهر لعملية التحويل الضوئي لـ M orange two كما تم وصفه سابقاً. بعد ذلك، قم بتكوين المجهر لعملية التبديل الضوئي لـ DPA. يتم استثارة DPA باستخدام ضوء بطول موجي 488 nanometer ويمكن تصوير تألقه باستخدام قناة التحويل الضوئي لـ M orange two.

تأكد من تقليل قدرة الليزر المستخدمة في تصوير MPA، حيث إن القدرة المفرطة لليزر ستؤدي إلى تثبيط MPA. أضف قناة للتنشيط الضوئي لـ MPA باستخدام إثارة ثنائية الفوتون بطول موجي 800 nanometer، ثم حدد قدرة الليزر المطلوبة لتصوير التنشيط الضوئي والتثبيط الضوئي لفلورة OFA.

تعد عملية تثبيط RPA دون تحويل M orange ضوئيًا من أصعب جوانب هذا الإجراء، وذلك لأن كلا الحدثين يحدثان عند الطول الموجي نفسه. ومن أجل منع حدوث ذلك، من المهم جدًا تحسين عملية التحويل الضوئي بدقة.

قدرة الليزر ومدته. يجب توخي الحذر لأن التحويل الضوئي لـ M orange two وتعطيل PU يحدثان معاً عند الإثارة بضوء طوله الموجي 488 nanometer؛ لذا يجب تعطيل PU دون تحويل ضوئي كبير لـ m orange two. استخدم قدرة ليزر أقل بمجرد تحديد المعايير الخاصة بالتحويل الضوئي لـ M orange two والتبديل الضوئي لـ DPA.

يمكن تحقيق الإبراز البصري باستخدام مسبار مزدوج. أولاً، يتم تثبيط فلورة DPA في كامل مجال الرؤية باستخدام إثارة منخفضة الطاقة عند 488 نانومتر. بعد ذلك، يتم اختيار المنطقة ذات الاهتمام وتحويل m orange two باستخدام إثارة عالية الطاقة عند 488 نانومتر.

أخيراً، اختر المنطقة المراد فحصها وقم بتنشيط فلورة DPA باستخدام إثارة الفوتونين بطول موجي 800 nanometer. تُعد عينات قطرات البروتين الفلورية مثالية لإعداد تطبيقات التحويل الضوئي باستخدام المجهر البؤري. عندما يتم تحضير عينة القطيرات بشكل صحيح، تظهر القطيرات متجانسة للغاية.

ومع ذلك، عندما يتم تحضير العينة دون تغطية شريحة المجهر بغطاء زجاجي، تميل القطيرات إلى الانضغاط مقابل أحد الأسطح الزجاجية في العينات المحضرة. وفي غياب 0.1%BSA، يميل البروتين الفلوري إلى التراكم عند واجهة مائية واحدة. ويعتمد تكوين هالة من التحويل الضوئي للفلورة بشكل حاسم على قدرة الليزر ومدة التعرض.

تؤدي قوة الليزر المفرطة أو مدة التعرض الطويلة جدًا إلى حدوث التبييض الضوئي، مما يؤدي إلى انخفاض في الفلورة الحمراء المحولة ضوئيًا. تسمح الخصائص الطيفية المتميزة لـ M orange two وPHO بالتمييز البصري المزدوج للمجسات قبل التحويل الضوئي؛ حيث تظهر الخلايا التي تعبر عن M orange two وhistone H two B وDPA mito فلورة برتقالية في النواة وفلورة خضراء في الميتوكوندريا. وعند إطفاء كافة الفلورة باستخدام استثارة منخفضة الطاقة بطول موجي 488 nanometer، يكون التحويل الضوئي لـ M orange في حدوده الدنيا.

يمكن تحويل M orange two ضوئياً إلى اللون الأحمر باستخدام إثارة عالية القدرة بطول موجي 488 نانومتر. وبمجرد تحويل M orange two ضوئياً، يمكن إعادة تشغيل تألق drawn puff باستخدام إثارة فوتونية ثنائية بطول موجي 800 نانومتر. وباستخدام التمييز البصري بالمسبار المزدوج، يمكن وسم الخلايا بأربع طرق متميزة.

باستخدام هذه التقنية، يمكن تمييز أربعة مجتمعات خلوية مختلفة بشكل محدد. وكما رأيتم، فإن أحد أصعب جوانب هذا الإجراء هو تثبيط MPA دون تحويل m orange ضوئياً. وبمجرد إتقان ذلك، يمكن إجراء تجارب إضافية باستخدام هذا النظام، مثل تتبع مجتمعات متعددة في خلايا بيتا البنكرياسية.

هذا كل شيء. آمل أن تكونوا قد وجدتم هذا العرض مفيداً، وتمنياتي لكم بالتوفيق في تجاربكم.