تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحميل الكرات النانوية (Nanospheres) على الأنيبيبات الدقيقة التي تنزلق على سطح مطلي ببروتينات الكينيسين الحركية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عبر طلاء سطح خلية تدفق زجاجية بمحلول الكازين. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في امتزاز بروتينات الكينيسين الحركية على سطح خلية التدفق.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة الأنابيب الدقيقة. والخطوة النهائية من الإجراء هي إضافة جزيئات strept haver، والتي سترتبط بالأنابيب الدقيقة، ثم إضافة الكرات النانوية. ترتبط الكرات النانوية بسطح خلية التدفق حيث يمكن للأنابيب الدقيقة التقاطها.

في النهاية، يمكن ملاحظة كيفية التقاط الكرات النانوية بواسطة الأنيبيبات الدقيقة ونقلها عبر السطح باستخدام المجهر الفلوري. مرحباً، أنا إيلين جين سميث من مختبر الدكتور هنري هيس وقسم علوم المواد والهندسة في جامعة فلوريدا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاختبار الحركة المقلوب.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تحميل الشحنات على الأنيبيبات الدقيقة وحركة المكوك الجزيئي. لذا، فلنبدأ. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير جميع المحاليل القياسية حديثاً كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الفيديو.

بمجرد تحضير المحاليل المخزنة، ابدأ بتجهيز الأنيبيبات الدقيقة عن طريق سحب 25 µL من محلول النمو باستخدام الماصة ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 mL. ثم أضف 6.25 µL من محلول النمو إلى 20 µg من التوبولين المبيوتيني المجفف بالتجميد. قم برج المحلول باستخدام جهاز الفورتكس وضعه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة لإتمام عملية البلمرة، وبعد الحضانة، قم بتخفيف المحلول بمقدار 100 ضعف في منظم تاكسول (Taxol Buffer) ورجه بلطف باستخدام جهاز الفورتكس.

يعمل هذا المحلول على تثبيت الأنيبيبات الدقيقة. قم بتسمية المحلول بـ empty 100 واحفظه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف بمقدار عشرة أضعاف لـ MT 100 في محلول anti fade المنظم وقم بتسمية هذا المحلول بـ MT 1000.

بعد ذلك، قم بتحضير محركات الـ Kinesin عن طريق تخفيف محلول kinesin بمقدار 20 ضعفاً في محلول TP buffer. ضع ملصقاً على المحلول باسم kinase in 20 واحفظه على الثلج. وأخيراً، قم بتحضير محاليل الستريبتيفيدين (streptavidin) والكرات النانوية (nanosphere).

أولاً، أضف الستريبتاديفين المسمى بـ Alexa Fluor 5 6 8 بتركيز 100 nano molars في Antifa Buffer. قم بتسمية المحلول STV 100، ثم خفف الكرات النانوية بمقدار 5,000 ضعف في Antifa Buffer وقم بتسمية هذا المزيج NS 5,000. احفظ كلا المحلولين فوق الثلج.

بعد تحضير المحلول الخاص بمقايسة تحميل الشحنة، قم بإنشاء خلية تدفق باستخدام شريحة غطاء وشريحة زجاجية رقيقة يفصل بينهما شريط لاصق مزدوج الوجه. أولاً، الصق شريطيين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه عند حواف شريحة الغطاء، مع ترك فجوة تبلغ حوالي سنتيمتر واحد بين الشريطين. ثم ضع الشريحة الرقيقة فوق الشريط اللاصق.

قم بتطبيق الضغط على غطاء الشريحة باستخدام الحافة المسطحة لملقط لإحكام الغلق. تبلغ أبعاد خلية التدفق التي تم إنشاؤها حوالي سنتيمترين طولاً، وسنتيمتر واحد عرضاً، و100 microns ارتفاعاً، ويبلغ حجمها حوالي 20 microliters. للبدء في تجميع المقايسة المقلوبة.

ضع طرف الماصة بين شريحة الغطاء والشريحة الزجاجية. ثم احقن 0.5 mg/mL من محلول الكازين في خلية التدفق. سيسمح هذا الطلاء لخلية التدفق لبروتين kinesin بالحفاظ على وظيفته عند الامتصاص.

انتظر لمدة خمس دقائق حتى تتكون طبقة من محلول الكازين. بعد ذلك، قم بامتزاز Kinesin على خلية التدفق عن طريق إدخال الكيناز في 20 محلول، حيث يتم إدخال المحاليل في خلايا التدفق بوضع طرف الماصة بين شريحة التغطية والشريحة الزجاجية. ثم يتم حقن المحلول في خلية التدفق من أحد الجانبين، بينما يتم سحبه في الوقت نفسه من الجانب الآخر.

باستخدام ورقة ترشيح، اترك الكيناز (kinase in) ليمتص لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإدخال الأنابيب الدقيقة إلى خلية التدفق عن طريق نقل محلول MT 1000 إلى خلية التدفق باستخدام الماصة. اترك الأنابيب الدقيقة لمدة خمس دقائق لتستقر وتلتصق بمحركات الكيناز (kinase in motors) بعد إتمام عملية ارتباط الأنابيب الدقيقة بمحركات الكيناز.

قم بتغليف الأنيبيبات الدقيقة ببروتين TTR المفلور والمرتبط بـ strep عن طريق إدخال محلول STV 100 في خلية التدفق. اترك جزيئات strep TTR لمدة خمس دقائق لتترابط مع الأنيبيبات الدقيقة. اغسل فائض strep TTR عن طريق إدخال ثلاث غسلات من محلول Antifa بحجم 30 microliter في خلية التدفق.

وأخيراً، يتم إدخال كرات الفلوريسين النانوية المصنوعة من البوليسترين والمبوتينة عن طريق نقل محلول NS 5,000 إلى خلية التدفق. حيث يمتص السطح الجسيمات الثابتة، وستصطدم الكرات النانوية بالأنيبيبات الدقيقة المتحركة وتلتصق بها.

في هذه التجربة، تم استخدام مجهر فلوري من طراز eclipse TE 2000 U مجهز بعدسة شيئية زيتية بقوة 100x وموقع X ومصباح 20 وكاميرا exon E-M-C-C-D. أولاً، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر فوق العدسة الشيئية. ثم قم بتثبيت خلية التدفق على منصة المجهر باستخدام مكعب ترشيح trixy.

قم بضبط تركيز الأنابيب الدقيقة، ثم انتقل إلى مكعب مرشح fitzy لعرض الكرات النانوية. بعد ذلك، افتح برنامج and or I exon واضبط وضع الحصول على البيانات على الوضع الحركي (kinetic). استخدم زمن تعريض قدره 0.5 seconds، وطول سلسلة حركية يبلغ 20، وزمن دورة حركية قدره six seconds.

قم بتحويل المجهر من العدسة العينية إلى الكاميرا وابدأ في التقاط الصور. بالنسبة للصور الأربع الأولى، استخدم مكعب trixi لتصوير الأنابيب الدقيقة. وبالنسبة للصور الـ 12 التالية، انتقل إلى مكعب مرشح Fitz لالتقاط صور للكرات النانوية.

ثم عُد إلى مكعب مرشح trixi. وفي الصور الأربع الأخيرة لتصوير الأنيبيبات الدقيقة، يتم رصد الأنيبيبات الدقيقة باستخدام مكعب مرشح Trissy، ويتم تحويل مكعب المرشح إلى fite. ولتصوير الكريات النانوية هنا، يتم تحديد الكريات النانوية التي تنقلها الأنيبيبات الدقيقة بواسطة الأسهم. ولم يتم التقاط جميع الكريات النانوية بواسطة الأنيبيبات الدقيقة.

يظهر الآن موقع الكرات النانوية بعد 36 ثانية، مما يكشف أن الكرات النانوية قد انزاحت. وعند تصوير الأنيبيبات الدقيقة مرة أخرى، يتضح أن الأنيبيبات الدقيقة قد انتقلت أيضاً عبر مجال الرؤية. وتُظهر هذه الصور أن الكرات النانوية قد أزيحت بسبب النقل بواسطة الأنيبيبات الدقيقة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة الحركة المقلوبة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تبديل مكعبات المرشح أثناء التقاط الصور حتى يتسنى رؤية كل من الأنيبيبات الدقيقة والكرات النانوية. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.